СПОСОБ ВАКЦИНОТЕРАПИИ ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2002 года по МПК A61K39/00 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к лечению онкозаболеваний.

Известно, что опухолевые клетки несут на своей поверхности иммуногенные детерминанты. Сам факт иммуногенности опухоли подразумевает возможность использования иммунотерапии в лечении онкологических заболеваний. Важное значение также имеет то, что опухоли разного гистологического типа могут экспрессировать одинаковые опухолеассоциированные антигены (ОАГ). Такое антигенное сходство, по-видимому, свидетельствуют о значительном сходстве внутриклеточных механизмов, лежащих в основе малигнизации разных типов клеток. Важно заметить, что ОАГ в большинстве своем являются филогенетически древними. Отсюда имеет место высокая степень гомологии между ОАГ человека и животных.

Наличие ОАГ, само по себе, в большинстве случаев, однако, недостаточно для развития устойчивого эффективного противоопухолевого иммунитета. Согласно имеющимся данным [3, 9] низкая иммуногенность опухоли может обусловливаться:
1) отсутствием мембранной экспрессии продуктов главного комплекса гистосовместимости (ГКТ), способных комплексироваться с ОАГ;
2) отсутствием мембранной экспрессии костимуляторных молекул (LFA3, CD40, CD54, CD80/86), необходимых для полномасштабной активации Т-лимфоцитов, распознающих ОАГ в комплексе с продуктами ГКТ. В отсутствие взаимодействия костимуляторных молекул со своими лигандами (CD2, CD40L, ICAM, CD28) антигенная стимуляция приводит к анергии или делеции ОаАГ-специфичных Т-лимфоцитов;
3) дефицитом в опухолевом микроокружении иммуностимулирующих цитокинов (прежде всего интерферона (ИФ)-гамма и интерлейкина(ИЛ)-2), и
4) продукцией клетками опухоли иммуносупрессорных цитокинов, таких, например, как трансформирующий ростовой фактор (ТРФ)-бета и ИЛ-10.

Цель иммунотерапии - преодолеть барьеры, стоящие на пути развития эффективного противоопухолевого иммунного процесса и увеличить количество в организме сенсибилизированных Т-лимфоцитов, способных реагировать на ОАГ по вторичному типу, что, в свою очередь, создает предпосылки для полномасштабной Т-клеточной активации относительно низкоиммуногенными интактными опухолевыми клетками [2, 3, 7].

Согласно имеющимся данным вакцинация опухолеассоциированными пептидами в принципе может приводить к формированию устойчивого противоопухолевого иммунитета [7]. Презентация пептидов Т-лимфоцитам в этом случае осуществляется дендритическими клетками и макрофагами, имеющими полный набор средств для запуска Т-клеточной активации. Важно, однако, заметить, что развитие иммунного ответа на одну или несколько опухолеассоциированных детерминант зачастую не приводит к замедлению развития опухолевого процесса, а лишь дает селективные преимущества для роста тем опухолевым клеткам, которые не экспрессируют эти детерминанты [7]. Иммунизация организма опухолевыми клетками в этом отношении выглядит более предпочтительной, так как позволяет индуцировать иммунные реакции на широкий спектр ОАГ. Увеличения иммуногенности аутологичных опухолевых клеток можно достичь следующим образом:
1) генетически модифицировать их таким образом, чтобы заставить одновременно экспрессировать на своей поверхности ОАГ, комплексированные с продуктами ГКГ, и костимуляторные молекулы, способные взаимодействовать с соответствующими экспрессированными на Т-лимфоцитах лигандами [9].

2) вставить в них функционально активные гены, колерующие иммуностимуляторные цитокины (ИЛ-2, ИФ-гамма, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-12) [18].

Указанные подходы, однако, трудно реализуемы в клинической практике, поскольку возможности модификации аутологичных опухолевых клеток имеют не только технические, но и временные ограничения. Поэтому было обращено внимание на возможность использования в иммунотерапии чужеродных аллогенных опухолевых клеток. Эффективность такого подхода была доказана экспериментально. Предполагается, что аллоантигены в этом случае обеспечивают дополнительный стимул для развития противоопухолевых иммунных реакций [15]. В настоящее время в ряде клиник начата клиническая апробация (I и II фаза клинических испытаний) этого подхода [2, 5]. Следует, однако, заметить, что использование аллогенных клеток в качестве индукторов противоопухолевого иммунитета также имеет ряд ограничений. Во-первых, поскольку распознавание ОАГ рестриктировано продуктами ГКГ, необходимо, чтобы используемые для иммунизации аллогенные клетки имели общие с опухоленосителем антигены ГКГ. Во-вторых, как уже было замечено, опухолевые клетки, как правило, не несут на своей поверхности костимуляторные молекулы, а значит сами по себе не могут обеспечить эффективную активацию интактных опухолеспецифичных Т-лимфоцитов.

Целью заявляемого изобретения является стимуляция противоопухолевых иммунных реакций, приводящих к формированию эффективного долговременного противоопухолевого иммунитета. Это достигается вакцинацией опухоленосителя (человека) ксеногенными (например, мышиными) опухолевыми клетками. Человек и мышь являются по отношению друг к другу дискордантными видами. Это означает, что в сыворотке крови человека в обязательном порядке присутствуют естественные антитела, способные вызвать острое отторжение трансплантированных мышиных клеток. Большая часть этих антител (составляющая примерно 1% сывороточных иммуноглобулинов) распознают на ксеногенных клетках альфа-галактозильный эпитоп (клетки человека не экспрессируют этот эпитоп из-за отсутствия в них фермента - альфа-1,3-галактозилтрансферазы). На основе имеющихся данных [1, 6, 11] можно полагать, что попадание ксеногенных опухолевых клеток в организм человека включает работу следующего иммунного механизма.

1. Сывороточные антигалактозильные антитела и комплемент покрывают поверхность ксеногенных опухолевых клеток и индуцируют процесс их разрушения.

2. Через взаимодействия с Fc-рецепторами и рецепторами к компонентам комплемента антигенный материал попадает в макрофаги и дендритические клетки.

3. Макрофаги и дендритические клетки презентируют антигенные детерминанты в комплексе с продуктами ГКГ II и I класса Т-хелперам (CD4⁺) и предшественникам цитолитических Т-лимфоцитов (CD8⁺) соответственно. Взаимодействие экспрессирующихся на антиген-презентирующих клетках костимуляторных молекул с соответствующими Т-клеточными мембранными лигандами, а также продуцируемые этими клетками иммуностимуляторные цитокины (ИЛ-12, фактор некроза опухоли (ФНО)-альфа, ИЛ-4 и др.) осуществляют эффективную костимуляцию антигенспецифических CD4⁺ Т-лимфоцитов.

4. Т-хелперы, активированные ОАГ и ксеноантигенами, посредством продукции цитокинов (ИФ-гамма, ИЛ-2 и ИЛ-15 и др.) стимулируют функциональную активность клеток, обладающих неспецифической противоопухолевой активностью (макрофаги, костномозговые цитостатические эффекторы, естественные цитотоксические и киллерные клетки). Активация этих клеток приводит к торможению опухолевого роста и ассоциируется с усилением экспрессии на клетках опухоли продуктов ГКГ.

5. Опухолеспецифические CD8⁺ цитолитические Т-лимфоциты, а также их предшественники распознают экспрессированные на поверхности опухолевых клеток комплексы, состоящие из ОАГ и продуктов ГКГ I класса, и после контактной и цитокиновой костимуляции со стороны активированных Т-хелперов и профессиональных антиген-презентирующих клеток вступают в фазу активного роста.

6. Высокая активность Т-клеточных цитолитических клонов, направленная против широкого спектра ОЛГ, приводит к лиминации опухоли из организма.

Предложенный подход к лечению онкозаболеваний не имеет ранее упомянутых ограничений. В основе его эффективности лежит вовлечение большого количества аутологичных профессиональных антиген-презентирующих клеток в процесс индукции противоопухолевых иммунных реакций.

Преимущества ксеновакцинотерапии перед методами лечения, основанными на использовании аутологичных или аллогенных клеточных вакцин, заключается в следующем:
1) она не требует использования бактериальных или цитокиновых адъювантов;
2) вовлекает в формирование противоопухолевых клеточных реакций естественный (пресуществующий иммунитет); и
3) решает проблему эффективной (иммуногенной) презентации ОАГ Т-лимфоцитам.

В качестве индукторов (стимуляторов) противоопухолевого иммунитета были использованы клетки мышиных перевиваемых опухолевых линий. Конкретный выбор клеток для иммунизации осуществлялся на основе данных о происхождении опухоли и о реактивности (ареактивности) лимфоцитов пациента по отношению к тем или иным ОАГ (определяется по кожной реакции гиперчувствительности замедленного типа). Клеточная вакцина формируется из клеточных линий, экспрессирующих широкий спектр ОАГ. В ее состав в обязательном порядке включалась линия, которая, помимо ОАГ, экспрессирует структуры, обладающие выраженным иммуноадъювантным действием. Одна вакцинирующая доза включала в себя 5•10⁷ инактивированных облучением или разрушенных клеток, первый индуцирующий курс включал в себя 4 внутрикожные/подкожные иммунизации с интервалом в 14 дней, второй консолидирующий курс 4 иммунизации с интервалом в 30 дней и третий поддерживающий курс вакцинации с интервалом в 30 или 90 дней.

В рамках проводимого в Институте клинической иммунологии СО РАМП клинического испытания ксеновакцинотерапии (протокол 6 от 6 октября 1998 г.) было пролечено 29 онкопациентов с III (10) и IV (19) стадией заболевания (меланома - 13, колоректальный рак - 9, рак пищевода - 1; рак молочной железы - 1, рак тела матки - 1; рак легкого - 2, рак яичника - 1; рак слюной железы - 1) со сроком наблюдения от 6 до 15 месяцев. Анализ результативности лечения проводили с использованием общепринятых критериев ВОЗ. Пациенты обследовались раз в 4 месяца. Согласно полученным на текущий момент предварительным данным клинический эффект (полная ремиссия, частичная ремиссия, стабилизация болезни) получен у 23 пациентов (80%). У подавляющего большинства отвечающих на вакцинотерапию пациентов отмечено усиление клеточной реактивности на ОАГ (кожная проба, реакция бласттрансформации лимфоцитов in vitro). Никаких заслуживающих внимания побочных эффектов ксеновакцинотерапии зарегистрировано не было.

Примеры:
1) Больной Б. 64 г. Был оперирован по поводу меланомы (область правого плеча) в 1996 г. Рецидив заболевания с развитием метастатических поражений лимфоузлов правой подмышечной впадины отмечен в июне 1997 г. Проведена метастазэктомия. В течение 1997-1998 г. проводились курсы полихимиотерапии. С августа 1998 г. по декабрь 1999 г. проводилась вакцинотерапия, которая включала в себя 19 вакцинаций, сделанных по вышеуказанной схеме. По состоянию на декабрь 1999 г. констатируется полная ремиссия, субъективный статус пациента - 0.

2) Больная Н. 51 год. В апреле 1998 г. поставлен DS: меланома в области правового бедра. Произведено иссечение первичного очага 23 апреля 1998 г. (IV степень инвазии по Кларку). В мае 1998 г проведен курс полихимиотерапии. В декабре 1998 г. при рентгенографическом обследовании обнаружены метастатические очаги в костной ткани. В марте 1999 г. при сцинтиграфическом обследовании выявлено метастатическое поражение L2 с вовлечением всего тела и боковых отростков и переходом на L3, поражение (3 см) в области правого подвздошно-крестцового сочленения. В это же время был начат курс полихимиотерапии, приведший к резкому ухудшению самочувствия больной и ее отказу от дальнейшего химиотерапевтического лечения. С апреля по декабрь 1999 г. проводится вакцинотерапия, включившая в себя 11 иммунизаций, выполненных по вышеуказанной схеме. По состоянию на декабрь 1999 констатируется стойкая стабилизация болезни, субъективный статус пациентки по критериям ВОЗ 0.

3) Больная В. 64 г. В 1993 г. оперирована по поводу аденокарциномы прямой кишки: эктирпация прямой кишки с наложением anus praeter neturalis (T3N0M0). В 1997 г. развился рецидив болезни По этому поводу проведена двухэтапная лучевая терапия. Летом 1998 г. отмечена прогрессия заболевания с прорастанием опухоли во влагалище. С сентября 1998 г по декабрь 1999 г. проводится вакцинотерапия (17 вакцинаций). По состоянию на декабрь 1999 г. инструментальных данных за прогрессию заболевания нет. По результатам осмотра онкогинеколога констатирована частичная регрессия опухоли (появился доступ к матке, ранее отсутствующий в результате массивного опухолевого пророста). Субъективный статус - 0.

Таким образом, полученные на сегодняшний день данные указывают на перспективность разработанного нового подхода к лечению онкозаболеваний.

Литература
1. Селедцов В. И. //Цитостатическая активность клеток костного мозга и клеточные механизмы ее регуляции: дис.... докт. мед. наук. - Новосибирск, ИКИ СО РАМН - 1998. - 175 с.

2. Arienti F. , Sule-Suso J., Belli F. et al.// Human Gene Therapy. - 1996. - Vol.7. - P.1955-1963.

3. Chen L. //Immunol. Today. - 1998. - Vol.19. - P.27-30.

4. Disis M.L., Cheever M.A.// Current Opinion in Immunology. - 1996. - Vol.8. - 637-642.

5. Fenton R. Т. , Sznol M., Luster D.G. et al.// Human Gene Therapy - 1995. - Vol.6. - P.87-106.

6. Galili U., LaTemple C.// Immunol. Today. - 1997. - Vol.18. - P.138-146.

7. Knuth A., Jager E. // Symposium in Immunology YI, Springer - Verlag, Heidelberg. - 1997. - P.125-135.

8. Melief C.J.M., Offringa R., Toes R.E.M., Kast W.M.// Current Opinion in Immunology. - 1996. - Vol.8 - 651-657.

9. Meuer S., Rudy W., Habicht A. et al. // Symposium in Immunology YI, Springer-Verlag, Heidelberg. - 1997. - P.77-88.

10. Miles D.// Cancer Treatment Reviews. - 1997. - Vol.23.

11. Mosman T.R., Sad S. // Immunol. Today. - 1996. - Vol.17 - P.138-146.

12. Plautz G. E. , Yang Z-Y., Wu B-Y. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - Vol.90. - P.4645-4649.

13. Rosenberg S.A. // Immunol. Today - 1997. - Vol.18. - P.175-182.

14. Seliger B., Huber C. // Symposium in Immunology YI, Springer-Verlag, Heidelberg. - 1997. - P.23-35.

15. Srivastava P.K.// Symposium in Immunology YI, Springer-Verlag, Heidelberg. - 1997. - P.159-168.

16. Van den Eynde В.J., Gaugler В., Brandle D. et al. // Symposium in Immunology YI. Springer-Verlag, Heidelberg. - 1997. - P.1-11.

17 Yee C., Riddell S.R., Greenberg Ph.D.// Current Opinion in Immmunology. - 1997. - Vol.9. - 702-708.

18. Zier К. , Gansbacher В., Salvadory S. // Immunol. Today - 1996. - Vol.17. - P.39-45.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для вакцинотерапии опухолей. Предложено проводить стимуляцию противоопухолевых иммунных реакций посредством вакцинации человека ксеногенными опухолевыми клетками, полученными от животных (например, мышей), дискордантных по отношению к человеку. Способ позволяет повысить эффективность вакцинотерапии злокачественных опухолей. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ вакцинотерапии онкозаболеваний, основанный на иммунизации организма разрушенными опухолевыми клетками, отличающийся тем, что стимуляцию противоопухолевых иммунных реакций осуществляют посредством вакцинации человека ксеногенными опухолевыми клетками. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вакцинацию человека проводят опухолевыми клетками, полученными от животных (например, мышей), дискордантных по отношению к человеку.