СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В-ЛИМФОЦИТОВ IN VITRO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОФЛАВОНОИДА ИЗ КОРНЯ ШИПОВНИКА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к биологии и медицине и может применяться для изучения стадий и регуляторных механизмов созревания B-лимфоцитов, изучения особенностей иммунопатогенеза заболеваний, разработки стратегии и контроля за иммуномодулирующей терапией.

Известен способ оценки пролиферативной активности B-лимфоцитов in vitro, включающий выделение мононуклеарных клеток /МНК/ из периферической крови людей, их культивирование в присутствии B-клеточного митогена и учет пролиферативной активности клеток радиоизотопным методом, отличающийся тем, что в качестве B-клеточного митогена применен формалинизированный золотистый стафилококк /Staphylococcus aureus CowanI, SAC/ /Romagnani S. The molecular basis of B-cell differentiation and function. New York, 1986, p.67-68/.

Недостатком способа является то, что митоген SAC обладает низкой степенью стимуляции пролиферации B-лимфоцитов, что затрудняет оценку митоген-индуцированной пролиферации B-лимфоцитов человека в сравнении со спонтанной пролиферацией B-лимфоцитов, которая может значительно варьировать по интенсивности у разных людей.

Известен способ оценки пролиферативной активности B-лимфоцитов in vitro, включающий выделение МНК из периферической крови людей, их культивирование в присутствии B-клеточного митогена и учет пролиферативной активности клеток радиоизотопным методом, в котором в качестве B-клеточного митогена применен экстракт растения лаконоса, митоген лаконоса /Pokeweed Mitogen, PWM/ /Waldemann T. A. Broder S. Polyclonal B-cell activators in the study of the regulation of immunoglobulin synthesis in the human system/ /advances in immunology, 1982, vol.32, p.1-63/.

Недостатком способа является то, что PWM действует на B-лимфоциты обязательно в присутствии моноцитов /Мц/ и T-лимфоцитов. Это не позволяет оценить изолированно пролиферативную активность только B-лимфоцитов.

Задачей изобретения является создание способа оценки пролиферативной активности B-лимфоцитов in vitro, который позволял бы оценить активность только B-лимфоцитов без участия регуляторных факторов со стороны Мц и T-лимфоцитов.

Для этого в способе оценки пролиферативной активности B-лимфоцитов in vitro, включающем выделение МНК из периферической крови людей, их культивирование в присутствии B-клеточного митогена и учет пролиферативной активности радиоизотопным методом, в качестве B-клеточного митогена применен биофлавоноид из корня шиповника /БКШ/.

Пример. Способ выполняли следующим образом. МНК периферической крови людей выделяли на одноступенчатом градиенте плотности фиколлаверографина /1,078 г/см³/ и трижды отмывали забуференным физиологическим раствором /культура B-лимфоцитов, дополненных T-лимфоцитами и Мц/. Освобождение культуры МНК от Мц проводили путем адгезии Мц к пластиковой поверхности на чашках Петри в течение 60 мин в газовом инкубаторе при 37^oC /культура B-лимфоцитов, дополненных T-лимфоцитами/. Получение культуры МНК, освобожденных от T-лимфоцитов, приводили методом двукратного осаждения E-розеткообразующих клеток /культура B-лимфоцитов, дополненная Мц/. Получение обогащенной суспензии B-лимфоцитов проводили методом освобождения МНК от Мц на чашках Петри с последующим двукратным осаждением E-розеткообразующих клеток /культура B-лимфоцитов/.

Культивирование проводили в триплетах, в лунках 96-луночных планшетов для иммунологических исследований при 37^oC в газовом инкубаторе в течение 120 ч в культуральной среде, состоящей из среды RPMI-1640, дополненной инактивированной сывороткой человека AB/IV/ группы, HEPES буфером, α-глютамином и антибиотиками. В лунки в количестве 33% от общего объема вносили или культуральную среду /1-й контроль/, или PWM /2-й контроль/, или БКШ /опыт/.

Интенсивность пролиферации клеток оценивали по включению в нуклеопротеидные фракции лимфоцитов радиоактивного вещества ³H-тимидина, который вносили в лунки за 18 ч до окончания культивирования.

Результаты оценки активности пролиферации B-лимфоцитов трех доноров приведены в табл.1-4, где использованы следующие обозначения: B B-лимфоциты, T T-лимфоциты, Мц моноциты, PWM митоген лаконоса, БКШ биофлавоноид из корня шиповника.

В табл. 1 приведены данные по спонтанной пролиферации культуры B-лимфоцитов в присутствии T-лимфоцитов и моноцитов без митогена /1 строчка/, в присутствии митогена лаконоса /PWM/ /2строчка/ и в присутствии БКШ /3 строчка/.

Как видно из табл. 1, в культуре B-лимфоцитов, дополненной T-лимфоцитами и моноцитами, митоген лаконоса /PWM/ достоверно усиливает пролиферацию лимфоцитов, в то время как БКШ достоверно не активен.

В табл. 2 приведены данные по пролиферации культуры B-лимфоцитов в присутствии T-лимфоцитов, но без моноцитов, без митогена /1 строчка/, в присутствии митогена лаконоса /PWM/ /2 строчка/ и в присутствии БКШ /3 строчка/.

Как видно из табл. 2, в культуре B-лимфоцитов, дополненных T-лимфоцитами, но освобожденными от моноцитов, митоген лаконоса достоверно усиливает пролиферацию лимфоцитов, в то время как БКШ достоверно не активен.

В табл. 3 приведены данные по пролиферации культуры B-лимфоцитов в присутствии МЦ, но без T-лимфоцитов, без митогена /1 строчка/, в присутствии митогена лаконоса /PWM/ и в присутствии БКШ /3 строчка/.

Как видно из табл. 3, в культуре B-лимфоцитов, дополненной моноцитами, но без T-лимфоцитов, и митоген лаконоса, и БКШ не активны.

В табл. 4 приведены данные по спонтанной пролиферации культуры B-лимфоцитов /1 строчка/, в присутствии митогена лаконоса /PWM/ /2 строчка/ и БКШ /3 строчка/.

Как видно из табл. 4, в культуре B-лимфоцитов митоген лаконоса не активен, а БКШ достоверно и значительно усиливает пролиферацию B-лимфоцитов.

Таким образом, в культурах B-лимфоцитов, содержащих или T-лимфоциты, или моноциты, или T-лимфоциты и моноциты, митоген лаконоса /PWM/ усиливает пролиферацию лимфоцитов, а в культуре B-лимфоцитов, освобожденной от T-лимфоцитов и моноцитов, он не активен, то есть на чистую популяцию B-лимфоцитов митоген лаконоса /PWM/ не влияет.

В отличие от него биофлавоноид из корня шиповника /БКШ/ достоверно усиливает пролиферацию B-лимфоцитов /в культуре без T-лимфоцитов и моноцитов/.

При этом интенсивность влияния БКШ на пролиферацию культуры B-лимфоцитов достаточно велика: у донора 1 пролиферация усиливается в 3,8 раза; у донора 2 в 5,1 раза; у донора 3 в 7,2 раза.

Таким образом, с помощью предложенного способа можно оценить пролиферацию культуры B-лимфоцитов человека.

Источники информации
Панков Ю. А. Брюховецкая Е.В. Джумаев М.А. Технология выделения суммы катехинов и получения P-витаминного препарата из корневищ и корней шиповника морщинистого. Вопросы фармации на Дальнем Востоке, Хабаровск, 1980, с. 54-60.

Использование: биология, медицина, для оценки пролиферативной активности B-лимфоцитов in vitro. Сущность изобретения: из пробы периферической крови выделяют мононуклеарные клетки, культивируют их в присутствии B-клеточного митогена с последующим учетом результатов радиоизотопным методом, при этом в качестве B-клеточного митогена используют биофлавоноид из корня шиповника. 4 табл.

Способ оценки пролиферативной активности В-лимфоцитов in vitro, включающий выделение мононуклеарных клеток из периферической крови людей, их культивирование в присутствии В-клеточного митогена и учет пролиферативной активности клеток радиозотопным методом, отличающийся тем, что в качестве митогена используют биофлавоноид из корня шиповника.