ЦИТОСТАТИЧЕСКИЙ ФАКТОР ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2004 года по МПК A61K35/14 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к биологии и медицине. Идентифицирован новый растворимый фактор природного происхождения, обладающий иммунорегуляторными и противоопухолевыми свойствами. Цитостатический фактор (ЦФ), выделенный из ядросодержащих эритроидных клеток имеет молекулярный вес, меньший или близкий к 0.5 kDa. Он термостабилен, резистентен к ферментному протеолизу, а также к действию липазы и фосфолипазы, но чувствителен к обработке нейроминидазой. При проведении обратнофазовой хроматографии на колонке с сорбентом Нуклеосил С-18 ЦФ элгоируется при концентрации ацетонитрила 20-30%.

В процессе кроветворения происходит формирование клеточных линий, во многом различающихся друг от друга. Очевидно, что высокая пролиферативная и дифференцировочная активность кроветворных клеток нуждается в постоянном контроле. На взаимоотношениях между клетками разных дифференцировочных линий строится автономная, оперативно действующая система клеточного взаимоконтроля. Нарушения в этой системе приводят к разбалансировке кроветворения и неизменно связаны с самыми неблагоприятными для организма последствиями. В действительности, ранее было установлено, что клетки костного мозга обладают выраженной способностью супрессировать иммунные реакции [McGarry et al., 1982, 71:293-300, Bains et al., Cell. Immunol., 1982, 74:150-161; Козлов и соавт., докл. АН СССР 1984, 275:247-249] а также оказывать цитостатическое действие на рост лейкемических клеток in vitro [Sugiura et al.. Cancer Res. 1990, 50: 2582-2586; Кусмарцев и соавт. Успехи современной биологии 1994, 114(6): 705-714; Seledtsov et al., Immunobiology. 1995, 192:205-217]. Значимый вклад в цитостатический потенциал костного мозга вносят ядерные эритроидные клетки (ЭК), составляющие примерно 25% костномозговых клеток. Установлено, что ЭК мыши и человека обладают способностью подавлять гуморальные иммунные реакции посредством продукции иммуносупрессорных медиаторов [Mitasov et al., Ann. NY Acad. Sci. 1991, 628:399-406; Seledtsov et al., Immunobiology. 1998, 198:361-374]. Одним из таких медиаторов является трансформирующий ростовой фактор (ТРФ)-бета [Seledtsova et al., Immunology. 1997, 91:109-113; Seledtsov et al., Immunobiology. 1998, 198:361-374]. Другой медиатор ранее не был идентифицирован и является предметом настоящего патентования.

ЦФ мог бы быть использован при лечении аллергических и аутоиммунных заболеваний. В качестве цитостатического препарата он может быть применен при лечении онкозаболеваний и, в частности, гемобластозов. С фармацевтической точки зрения ЦФ имеет целый ряд несомненных достоинств. Он не обладает антигенными свойствами и, следовательно, его многократные инъекции не должны приводить к сенсибилизации, снижающей эффективность его действия, а также к аллергическим осложнениям. ЦФ термостабилен и устойчив к действию протеаз и липаз. Это подразумевает возможность относительно длительного персистирования экзогенного ЦФ в организме. Видонеспецифичность действия ЦФ, а также его низкий молекулярный вес создают важные предпосылки для получения его синтетического фукционально активного аналога.

Уровень техники. Сведения об идентифицированном нами ЦФ отсутствуют в научной литературе. Он никогда не исследовался и не использовался в качестве лекарственного средства. ЦФ отличен от всех белковых продуктов, обладающих цитостатической активностью. По молекулярной массе и хроматографическим характеристикам ЦФ отличен от ранее описанного костномозгового супрессорного фактора (BDSF, bone marrow-derived suppressor factor), представляющего собой гликолипид с мол. массой 1-3 kDa [McGarry et al., Cell. Immunol. 1982. 71:293-3005; Saffran D.C. and Singhal S., Tansplantation. 1991, 52:685-690; Singhal S, 1991, Patent number WO 919506; Cathcart M., 1989, Patent number US 4849507], а также от недавно идентифицированного костномозгового небелкового цитостатического фактора, получившего название рептимед (Reptimed), молекулярная масса которого находится меньше 1 kDa, но больше 0.5 kDa [De Koter et al., Cell. Immunol. 1997, 175:120-127]. Чувствительность ЦФ к действию нейраминидазы указывает на наличие в его составе функционально значимых сиалированных производных. Известно, что ганглиозиды, содержащие в своем составе такие производные, обладают выраженными иммуносупрессорными свойствами. Однако полноценные ганглиозиды отличны от ЦФ по молекулярной массе.

Согласно имеющимся данным [Weigandt H. Gangliosides as tumor antigens. Gangliosides and Cancer (ed. Oettgen H.F.), VCH Publishers, Weinheim, FRG, 5-15.] их молекулярная масса находится в пределах от 1.1 до 5.3 kDa.

Сущность изобретения. Заключается в идентификации нового фактора природного происхождения, обладающего иммунорегуляторными и противоопухолевыми свойствами.

ЦФ первоначально был идентифицирован в среде кондиционированной эритроидными клетками человека или мыши. Биологическую активность ЦФ оценивали по вызываемой им супрессии пролиферативного ответа клеток селезенки мыши на бактериальный липополисахарид (ЛПС), а также роста мышиной В-клеточной лимфомы L1210.

Согласно полученным нами данным ЦФ имеет молекулярную массу, меньшую или близкую к 0.5 kDa. Он термостабилен (выдерживает 80°С в течение 20 мин, 100°С в течение 5 мин), резистентен к ферментному (трипсин + химотрипсин) протеолизу, а также к действию фосфолипазы С и липазы, но чувствителен к обработке нейраминидазой. После воздействия нейраминидазы ЦФ теряет примерно 80% своей цитостатической активности.

Чувствительный к действию нейраминидазы низкомолекулярный ЦФ обнаруживается в культуральном супернатанте, полученном от нормальных мышиных костномозговых клеток. ЦФ может быть выделен из водно-солевого экстракта эритроидных клеток. На фиг.1 показан профиль элюции низкомолекулярных (<0.5 kDa) эритроидных продуктов при аналитической обратнофазовой хроматографии с сорбента Нуклеосил С-18 (размер колоники-2×40 мм; размер частиц сорбента - 5 мкм; элюенты: 0.1% трифторуксусная кислота и 5-95% ацетонитрил; скорость потока - 0.1 мл/мин). Детекцию проводили на трех длинах волн - 210, 260 и 280 нм. Как показано на фиг.1, ЦФ элюировался при концентрации ацетонитрила 20-30%. Максимальное поглощение света исследуемым веществом имело место при длине волны 210 нм, минимальное при 260 нм.

Полученные данные указывают на эритроидную природу исследуемого фактора. Однако это не исключает возможность его продукции другими клетками костномозгового или иного происхождения.

Сведения, подтверждающие, осуществляющие возможность осуществления изобретения. Методика получения ЦФ включала следующие этапы. Жизнеспособные кроветворные клетки печени (3-5×10⁶/мл) плода человека 16-22 недельной гестации культивировали в среде Искова, дополненной 20% сыворотки плодов коровы, 2 mM L-глютамипа, 5×10^-5 М меркаптоэтанола и антибиотиками, в присутствии человеческого эритропоэтина (1 Ед/мл) в течение 3-5 дней. Далее клеточную суспензию наносили на раствор перколла (плотность 1.070 г/мл), центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин. Неосевшие клетки аккуратно собирали и отмывали посредством центрифугирования в охлажденной среде RPMI 1640. По цитологическим данным процент ядерных эритроидных клеток в полученной таким образом клеточной популяции был близок к 100%. Для получения кондиционированной среды эритроидные клетки (5×10⁶/мл) культировали в бессывороточной среде RPMI 1640, дополненной 4 mM L-глютамина, 5×10^-5 М маркаптоэтанола и антибиотиками, в течение 24 ч. Далее кондиционированную среду, отделенную от клеток центрифугированием, подвергали температурной обработке (80°С в течение 20 мин), фильтровали через мембрану с диаметром пор 0.22 μm. Низкомолекулярный ЦФ отделяли от эритроидных продуктов, имеющих более высокий, чем у ЦФ, молекулярный вес посредством ультрафильтрации через мембрану YM 05 (Amicon) при 30-40 psi. До использования раствор, содержащий ЦФ, хранили при 4°С. Непосредственно перед использованием в экспериментах флакон с раствором (5-10 мл) помещали в кипящую воду на 5 мин.

В экспериментах, в которых оценивалась биологическая активность ЦФ, клетки культивировали в круглодонном 96-луночном планшете ("BDSL"), при 37°С, во влажной атмосфере с 5% СO₂, в среде RPMI 1640, содержащей 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5×10^-5 М меркаптоэтанола, 30 мкг/мл гентамицина и 5-7,5% фетальной бычьей сыворотки.

Активность ЦФ оценивали в следующих пролиферативных тестах:

1. Клетки селезенки (3×10⁵/лунка) нормальных мышей (СВА×C57BL/6)F1 (CBF1) стимулировали ЛПС (12 мкг/мл) в течение 48 ч.

2. Клетки селезенки мышей CBF1 и (C57BL/6×DBA)F1 (BDF1) культивировали совместно (по 2×10⁵ на лунку) в течение 48 ч. За это время в культурах происходила генерация двунаправленного пролиферативного ответа, которая предшествовала развитию цитотоксических клеточных реакций.

3. Мононуклеарные клетки (3×10⁵ в лунке), выделенные из гепаринизированной крови больных аллергическими заболеваниями посредством центрифугирования на растворе фиколл-верографина (плотность 1.078), культивировали в присутствии соответствующего аллергена (100 PNU/ml) в течение 48 ч.

4. Клетки мышиной опухоли (L1210, Р815, или Wehi 3) в количестве 10⁴ на лунку культивировали в 96-луночном планшете в течение 24 ч.

В опытных пробах клетки были прокультивированы в присутствии ЦФ или других исследуемых растворимых добавок. В контроле клетки были культивированы без каких-либо добавок, или в присутствии мышиных тимоцитов, неспособных супрессировать клеточный рост [Seledtsov et al., Immunobiology 1995, 192:205-217]. Уровень пролиферативной клеточной активности определяли стандартным методом по включению в клетки [³H]тимидина, добавленного во все лунки по 0.5 мкСi за 4-5 ч до окончания культивирования. Процент супрессии клеточной пролиферации вычисляли по формуле

Данные, представленные на фиг.2, указывают на способность ЦФ супрессировать дозозависимым образом индуцируемую ЛПС В-клеточную пролиферацию, а также пролиферативный Т-клеточный ответ, генерируемый в двунаправленной смешанной культуре лимфоцитов. Кроме того, как показано на фиг.3, ЦФ также способен дозозависимым образом ингибировать рост клеток лимфомы L1210 и мастоцитомы Р815.

ЦФ способен ингибировать аллергениндуцированные пролиферативные реакции лимфоцитов человека. Согласно полученным результатам ЦФ супрессировал на 30-85% пролиферативный ответ на аллерген мононуклеарных клеток пациентов (4 мужчин и 2 женщин), страдающих аллергическими заболеваниями (3 бронхиальной астмой и 3 поллинозом).

Изобретение относится к биологии и медицине. Идентифицирован новый цитостатический фактор природного происхождения, обладающий иммунорегуляторными и противоопухолевыми свойствами. Этот фактор может быть выделен из ядросодержащих эритроидных клеток. Он термостабилен, резистентен к ферментному протеолизу, а также к действию липазы и фосфолипазы, но чувствителен к обработке нейроминидазой, имеет молекулярный вес, меньший или близкий к 0.5 kDa. Идентифицированный фактор может найти применение при лечении аллергических, аутоиммунных и опухолевых заболеваний. Изобретение позволяет получить продукт, не обладающий антигенными и аллергическими свойствами, эффективен при длительном использовании. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Цитостатический низкомолекулярный фактор, выделенный из кроветворных клеток, имеющий молекулярную массу меньшую или равную 0,5 kDa, обладает иммунорегуляторными и противоопухолевыми свойствами, термостабилен, резистентен к ферментному протеолизу, а также к действию липазы и фосфолипазы, но чувствителен к обработке нейраминидазой.2. Способ получения цитостатического фактора по п.1, включающий в себя культивирование кроветворных клеток в среде Искова с эритропоэтином, центрифугирование, инкубацию выделенных ядросодержащих эритроидных клеток в бессывороточной среде, сбор кондиционированной клетками среды, отделение фактора от других клеточных продуктов посредством ультрафильтрации и выделение целевого продукта путем аналитической обратно-фазовой хроматографии с сорбента Нуклеосил-18.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что цитостатический фактор может быть получен из эритроидного клеточного экстракта.4. Способ по п.2, отличающийся тем, что цитостатический фактор может быть получен из костно-мозговых клеток.5. Способ по п.2, отличающийся тем, что получение чистого цитостатического фактора проводится посредством обратнофазовой хроматографии.6. Продукт, обладающий иммунорегуляторным действием, содержащий цитостатический низкомолекулярный фактор, выделенный из кроветворных клеток, по пп.2-5.7. Продукт, обладающий противоопухолевым действием, содержащий цитостатический низкомолекулярный фактор, выделенный из кроветворных клеток, по пп.2-5.