ОКТА-4,5-КАРБОКСИФТАЛОЦИАНИНЫ КАК ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2002 года по МПК C07D487/22 A61K31/409 A61K49/00 

Изобретение относится к фармацевтической химии, а более конкретно к препаратам для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных опухолей и других патологических новообразований.

Метод ФДТ основан на использовании фотосенсибилизаторов, которые при введении в организм локализуются преимущественно в опухоли, а при световом, в частности лазерном возбуждении, продуцируют цитотоксические вещества, прежде всего синглетный кислород. В настоящее время в клинической практике применяются фотосенсибилизаторы на основе сложных смесей производных гематопорфирина, например Fotofrin-II (E. Sternberg, D. Dolphin, С, Bruckner. Tetrahedron, 54, 4151 (1998)). Недостаток этих фотосенсибилизаторов заключается в том, что их коэффициент экстинкции в наиболее длинноволновой полосе (620-640 нм) относительно невысок, в то время как поглощение несенсибилизированных тканей в этой области весьма значительно. Это уменьшает глубину проникновения излучения в ткани, что затрудняет лечение опухолей больших размеров и требует увеличения доз вводимого в организм препарата и терапевтического излучения.

Эти недостатки частично устраняются при использовании для ФДТ фотосенсибилизатора - сульфированного фталоцианина алюминия ("Фотосенса"), поглощающего в спектральном диапазоне 660-680 нм с коэффициентом экстинкции в максимуме, превышающем 10⁵ л•моль^-1•см^-1. Поглощение несенсибилизированных тканей в диапазоне 660-680 нм падает, при этом растет глубина фотодинамического воздействия на ткани, что позволяет в целом повысить эффективность ФДТ. Этот препарат наиболее близок к предлагаемым фотосенсибилизаторам и поэтому выбран в качестве аналога:

Однако "Фотосенс" обладает все же недостаточно высоким контрастом накопления в опухолевой ткани, следовательно, весьма высокой величиной используемой дозы (0,5-0,8 мг на кг веса тела), следствием чего является, учитывая малую скорость его выведения из организма, наличие у него нежелательной кожной токсичности.

Задачей предлагаемого изобретения является изыскание новых фотосенсибилизаторов, которые обладали бы увеличенной селективностью накопления в опухолевой ткани, не уступая в эффективности "Фотосенсу" по другим показателям. Для решения этой задачи в настоящем изобретении в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ предлагаются окта-4,5-карбоксифталоцианины алюминия и цинка (в виде их натриевых солей):

Известно применение эти соединений в качестве сшивающих агентов для получения термостойких эпоксидных смол (Пат.США 3301814,260-37,1967).

Окта-4,5-карбоксифталоцианины (РсС8) алюминия и цинка получены взаимодействием диангидрида пиромеллитовой кислоты с солями соответствующих металлов, например хлористым алюминием и ацетатом цинка, в присутствии мочевины с последующим гидролизом промежуточно образующихся тетраимидов РсС8. A1PcC8 получен гидролизом тетраимида кипячением в 20%-ной серной кислоте, a ZnPcC8 - в 15%-ном триэтиленгликолевом растворе едкого кали. Для выделения чистых мономеров РсС8 и их отделения от примесей димеров и олигомеров использована хроматографическая очистка их водных растворов на окиси алюминия. РсС8 переведены в их натриевые соли растворением в рассчитанном количестве водного едкого натра и последующим упариванием растворов досуха.

Пример 1. Получение окта-4,5-карбоксифталоцианина алюминия (AlPcC8)
Тетраимид окта-4,5-карбоксифталоцианина алюминия
Смесь 47,0 г (0,212 моль) диангидрида пиромеллитовой кислоты, 7,26 г безводного хлористого алюминия (0,0545 моль), 127,2 г (2,12 моль) сухой мочевины и 1 г молибдата аммония сплавляют в течение 3 ч при 215-220^oС. Плав охлаждают до 80-90^oС, прибавляют горячую воду и смесь кипятят 1 ч, суспензию фильтруют, осадок промывают на фильтре горячей водой, отжимают и кипятят с 10%-ной водной соляной кислотой. Соляно-кислую суспензию фильтруют горячей, осадок на фильтре промывают горячей водной соляной кислотой и горячей водой до нейтральной реакции Соляно-кислую обработку повторяют дважды. Получают 30,1 г (68%) AlPcC8. ИК-спектр, таблетка КВr, см^-1: 1680, 1710, 1755 (С=О имидной группы).

Окта-4,5-карбоксифталоцианин алюминия
30,1 г измельченного тетраимида окта-4,5-карбоксифталоцианина алюминия прибавляют к 300 мл 20%-ной серной кислоты и кипятят при перемешивании в течение 72 ч. Суспензию фильтруют горячей, осадок на фильтре промывают горячей 5%-ной серной кислотой, затем горячей дистиллированной водой до нейтральной реакции, высушивают и получают 8.6 г технического AlPcC8, который измельчают и суспендируют в 100 мл дистиллированной воды и переводят в натриевую соль добавлением 1%-ного раствора едкого натра. Полученный раствор фильтруют и хроматографированием на окиси алюминия выделяют 2.65 г (8.1%) мономерного А1РсС8; 1.95 г смеси мономера и димера и 2.7 г олигомера. Мономер суспендируют в дистиллированной воде и добавлением 1%-ного раствора едкого натра до рН 8.9 переводят в натриевую соль. Раствор фильтруют, фильтрат упаривают досуха, сухой остаток измельчают, перемешивают с этанолом и высушивают при 106-110^oС. Получают с количественным выходом октанатриевую соль AlPcC8.

Найдено, %: С 42.24; Н 1,67; N 10,04.

С₄₀Н₈N₈А1Nа₈0₁₇•2Н₂0.

Вычислено, %: С 42,04; Н 1,06; N 9,81.

λ_макс, нм, в фосфатном буфере (рН 8):361, 614, 690.

Пример 2. Получение окта-4,5-карбоксифталоцианина цинка (ZnPcC8)
Тетраимид окта-4,5-карбоксифталоцианина цинка
Смесь 23.5 г (0.106 моль) диангидрида пиромеллитовой кислоты, 9.72 г безводного ацетата цинка (0.053 моль), 63.6 г (1.06 моль) сухой мочевины и 0.5 г молибдата аммония и 25 мл 1-бромнафталина перемешивают в течение 4 ч при 230-235^oС в токе азота. Охлажденную реакционную массу фильтруют, осадок на фильтре промывают бензолом, остаток кипятят с водой, суспензию фильтруют, осадок на фильтре отжимают и кипятят 1 ч с 5%-ной водной соляной кислотой, фильтруют, обработку соляной кислотой повторяют дважды. Осадок на фильтре промывают горячей водой до нейтральной реакции, отжимают и кипятят 1 ч с 740 мл 4%-ного водного раствора аммиака, раствор охлаждают, подкисляют 5%-ной соляной кислотой, суспензию фильтруют, осадок промывают последовательно 5%-ной соляной кислотой, кипятят горячей 5%-ной водной соляной кислотой, горячей дистиллированной водой, отжимают и высушивают. Выход очищенного имида 4.55 г (18.5%). ИК-спектр, таблетка КВr, см^-1: 1695, 1710, 1750 (С=O имидной группы).

Окта-4,5-карбоксифталоцианин цинка
30.1 г тетраимида ZnPcC8 прибавляют к раствору 21,6 г едкого кали в 127 мл триэтиленгликоля и нагревают при перемешивании в токе азота до 135^oС и перемешивают 2 ч при этой температуре. Реакционную массу охлаждают, выливают в 10%-ный водный раствор соляной кислоты. Суспензию фильтруют, осадок на фильтре промывают горячей водной соляной кислотой, затем горячей дистиллированной водой до нейтральной реакции, отжимают и высушивают. Получают 3.05 г (61%) технического ZnPcC8, который очищают хроматографированием на окиси алюминия. Выход чистого мономера 1.75 г (37%).

Найдено, %: С 40,87; Н 1.50, N 10,65.

C₄₀H₁₆N₈0₂₀Zn.

Вычислено, %: С 40,78; Н 1,37, N 9.51.

λ_макс, нм, в фосфатном буфере (рН 8): 354, 618, 686.

Октанатриевая соль ZnPcC8 получена с количественным выходом аналогично.

Физико-химические свойства
Натриевые соли АlРсС8 и ZnPcC8 представляют собой прекрасно растворимые в воде соединения, малорастворимые в спиртах и неполярных органических растворителях. В электронном спектре их растворов в воде и в фосфатном буфере с физиологическим значением рН 7,4 наблюдается интенсивная длинноволновая полоса Q в области 690 нм с четко выраженными колебательными спутниками, что свидетельствует об образовании ими истинных, неагрегированных растворов (максимумы при 690 нм для А1РсС8 и 686 нм для ZnPcC8). Введение детергента Triton Х-100 не приводит к изменению спектра, что подтверждает отсутствие агрегатов в растворе сенсибилизатора.

Для оценки эффективности AlPcC8 и ZnPcC8 как сенсибилизаторов были определены квантовые выходы синглетного кислорода (ϕΔ), высокая реакционная способность которого по отношению к биомолекулам в значительной мере определяет фототоксичность сенсибилизаторов в методе ФДТ.

Величины ϕΔ определяли относительно бенгальского розового в водном буферном растворе с рН 7.4. Акцептором синглетного кислорода служила растворимая в воде натриевая соль антрацен-9,10-диметил-бис(малоновой) кислоты, полученная по известному методу (Ю. Постовский, Н. Беднягина. ЖОрХ, 7, 2919 (1937)). Концентрация сенсибилизатора составляла ~ 10^-5 моль/л. Раствор красителя, содержащий 1•10^-3 моль/л акцептора, помещали в стандартную кювету с толщиной оптического слоя 1 см и облучали светом лампы ДКСШ-150 в длинноволновую полосу поглощения сенсибилизатора через стеклянный светофильтр ЖС-18 и интерференционный фильтр с максимумом пропускания 550 нм для бенгальского розового (стандарт) и 700 нм для фталоцианинов. Интенсивность световых потоков определяли, используя измеритель мощности Spectra Physics 404, долю поглощаемого образцом света рассчитывали интегрированием перекрывания спектров пропускания светофильтров и спектра поглощения красителей. Фотосенсибилизированное окисление акцептора синглетного кислорода контролировали спектрофотометрически по снижению поглощения в максимуме на длине волны 400 нм при толщине оптического слоя 0.05 см. Для расчета ϕΔ использовали соотношение:

где ϕΔ^БР - квантовый выход генерации синглетного кислорода бенгальским розовым в воде, равный 0.75 (D.C. Neckers. J. Photochem. Photobiol. A., 47, N 1 (1989)), w и w^БР - скорости расходования акцептора, сенсибилизированного МРсС8 либо бенгальским розовым соответственно, I - количество поглощенных сенсибилизатором в единицу времени квантов света.

Квантовые выходы ϕΔ составили 0.17±0.03 для А1РсС8 и 0.57±0.07 для ZnPcC8.

Накопление в тканях животных
Селективность накопления РсС8 оксиалюминия и цинка изучали на мышах с опухолью Эрлиха. Их содержание в тканях оценивали флюоресцентным методом на лазерной диагностической установке на основе He-Ne лазера (длина волны генерации - 633 нм) контактным способом ex vivo (N.N. Zharkova, D.N. Kozlov, Yu.N. Polivanov, et al. "Laser-excited fluorescence spectrometric system for tissue diagnostics", Proc. SPIE, vol. 2328, pp. 196-201, 1994). В качестве критерия использована константа селективности (Кс), представляющая собой отношение интенсивностей флюоресценции в опухоли и в окружающей ткани (коже).

Фотосенсибилизаторы вводили внутривенно в дозе 5 мг/кг, флюоресценцию регистрировали через 24 и 48 ч. В качестве контроля сравнения вводили "Фотосенс" в дозе 2 мг/кг (доза препарата, при которой Кс "Фотосенса" в опухоли Эрлиха - максимальна). (Kazachkina N.I., Zharkova N.N., Fomina G.I. et al Pharmacokinetical study of Al- and Zn-sulphonated phthalocyanines. Proc. SPIE, vol. 2924, pp. 233-249, 1996). Эксперименты показали, что оба фотосенсибилизатора имеют максимум флюоресценции в тканях мышей при 698 нм, избирательно накапливаются в опухоли Эрлиха с константой селективности в 3-4 раза выше, чем у "Фотосенса" (таблица 1).

Фотодинамическая терапия
АlРсС8 и ZnPcC8 вводили внутривенно в дозах 5 и 25 мг/кг мышам BDF₁ с опухолью Р-388, привитой подкожно в область икроножной мышцы правой лапы, и с опухолью Эрлиха, привитой подкожно в подлопаточную область справа. Через 4 ч после этого опухоли облучали красным светом (фильтры Кс-10 и СЗС-26, λ≥630 нм), используя излучатель АТО-1 (НПО "Полюс") на основе галогеновой лампы (150 Вт, "Olympus", Япония) с оптоволоконным жгутом. Диаметр светового пятна составлял 1.5 см, плотность мощности - от 120 до 360 мВт/см², световая доза - от 108 до 324 Дж/см².

В качестве контроля сравнения вводили "Фотосенс" в дозе 5 мг/кг (максимально переносимая доза препарата у животных с привитой на лапу опухолью при плотности энергии - 400 Дж/см²). Облучение проводили через 24 ч после введения препарата.

Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) и увеличению продолжительности жизни мышей (УПЖ) относительно соответствующих величин у животных, не подвергавшихся каким-либо воздействиям. Биологически значимыми считали ТРO≥50% и УПЖ≥25% (Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США 1980, М., Медицина - С. 71-106).

В результате проведенных экспериментов показано, что ФДТ с РсС8 оксиалюминия и цинка подавляет рост опухоли Эрлиха (таблица 2).

Провести сравнение терапевтической эффективности РсС8 и "Фотосенса" в отношении опухоли Эрлиха не представляется возможным, так как при данной локализации опухоли при использовании в ФДТ "Фотосенса" в дозе 5 мг/кг наблюдается 100% гибель мышей.

Доза фотосенсибилизатора 25 мг/кг, световая доза - 324 Дж/см².

У мышей с Р-388 (таблица 3) величины ТРО в группах, получавших РсС8 с последующим облучением, тем больше, чем выше доза фотосенсибилизатора и световая доза.

Применение РсС8 цинка в качестве фотосенсибилизатора приводит к увеличению продолжительности жизни леченых мышей с Р-388. Биологически значимые величины УПЖ наблюдаются в группах, получавших РсС8 цинка с последующим облучением в дозе 324 Дж/см². Здесь УПЖ составляла 29-35% в зависимости от дозы фотосенсибилизатора. ФДТ с "Фотосенсом" в максимально переносимой дозе при данной локализации опухоли также приводит к торможению роста опухоли и увеличению продолжительности жизни подопытных мышей. Однако она несколько ниже, чем при применении октакарбоксифталоцианина цинка.

Таким образом, предлагаемые в настоящем изобретении новые фотосенсибилизаторы обладают увеличенной селективностью накопления в опухолевой ткани, не уступая используемому аналогу в эффективности ФДТ.

Изобретение относится к области медицины и касается применения окта-4,5-карбоксифталоцианинов алюминия или цинка формулы

где M= AlOH, Zn, в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии. Предлагаемые фотосенсибилизаторы обладают увеличенной селективностью накопления в опухолевой ткани. 3 табл.

Применение окта-4,5-карбоксифталоцианинов в виде их натриевых солей общей формулы

где M= AlOH, Zn,
в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии.