ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE КМ 138 СЕРОГРУППЫ 0139 - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО 0139 АНТИГЕНА Российский патент 2002 года по МПК C12N1/21 A61K39/106 C12N1/20 C12N15/00 C12N1/21 C12R1/63 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению штамма, и может быть использовано в производстве для получения холерной диагностической 0139-антисыворотки.

Известен штамм P16064 0139-серогруппы, продуцирующий полисахаридную капсулу, которая свободно лежит на поверхности бактериальной клетки, маскируя 0-боковые цепи ЛПС, препятствуя формированию 0139-специфических антител (Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И. и др. Филогенетический анализ двух морфологически разных типов колоний Vibrio cholerae 0139. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1995. - 3. С. 30-34). Данный штамм имеет низкий уровень антигенности по 0139-антигену, антитела в антисыворотке, полученной против штамма P16064, агглютинируют его же клетки лишь в разведении 1:200.

Известен также спонтанный бескапсульный штамм Vibrio cholerae P16064 сар^- 0139-серогруппы KM137, который получен при выращивании капсульного штамма P16064 в LB бульоне при 37^oС в течение 18 ч и последующем рассеве полученной культуры до изолированных колоний на агаре Мартена. Образование спонтанных бескапсульных клонов в этих условиях происходит с частотой 3,0•10^-3. Сыворотка, полученная против штамма КМ137, агглютинирует капсульные штаммы в титре 1:800, а бескапсульные - 1:600.

Для получения холерной высокочувствительной диагностической 0139-антисыворотки необходим штамм с высоким выходом продукции 0139-антигена.

Задачей изобретения является получение стабильного бескапсульного штамма Vibrio cholerae 0139-серогруппы с высокой продукцией 0139-антигена.

Сущность изобретения заключается в том, что заявляемый полученный штамм удовлетворяет поставленным требованиям.

Определяющим отличием предлагаемого штамма является высокий уровень антигенности.

Культурально-морфологические свойства штамма
Подвижные, слегка изогнутые палочки. На твердых питательных средах растет в виде круглых с ровными краями прозрачных голубоватых колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение среды. Хорошо растет при рН среды 7,6, при температуре 37^oС. Прототроф.

Ферментирует до кислоты без газа маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу. Не ферментирует лактозу и арабинозу. Не лизирует эритроциты барана.

Резистентен к диагностическим холерным фагам С и Эльтор.

Резистентен к антибиотикам стрептомицину (100 мкг/мл), канамицину (50 мкг/мл).

Вирулентен, холерогенный эффект наблюдается при заражающей дозе 105 м.т. на модели крольчат сосунков, в хромосоме присутствуют vсt гены.

Штамм агглютинируется 0139-специфической холерной сывороткой.

Не агглютинируется диагностическими холерными сыворотками О, Инаба, Огава, RO.

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии.

Получение штамма-продуцента 0139-антигена описано ниже.

Предлагаемый штамм получен методом инсерционного мутагенеза с использованием транспозона Тn51S50_L::рhоА (TnphoA), кодирующего резистентность к канамицину, в качестве мутационного агента. В клетки исходного капсульного штамма Р16064 конъюгацией вводят плазмиду - "самоубийцу" pRT733, определяющую резистентность к ампицилину (Ар^R), а также за счет присутствия в ней транспозона TnphoA устойчивость к канамицину (Кm^R). Донором данной плазмиды служит штамм Е. coli SM10 (pRT733) (Manoil С., Beckwith J. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985, Vol. 82, 23, P. 8123-8133). Скрещивание проводят на плотной питательной среде. Селективной средой служила минимальная среда с добавлением канамицина (50 мкг/мл). Селектируемым классом являются трансконъюганты Km^R Am^S, поскольку такой фенотип должны иметь клоны, несущие внедренный в хромосому транспозон TnphoA (Km^R), но утратившие плазмидный репликон с маркером Ар^R. Инсерция транспозона могла произойти в различные сайты хромосомы штамма Р16064, поэтому у полученных трансконъюгантов была проверена продукция 0139-антигена и капсулы. Продукция капсулы четко коррелирует с морфологией колоний. Капсульный штамм Р16064 при рассеве на плотных питательных средах формирует мутные непрозрачные колонии (Р16064-0). Среди полученных трансконъюгантов обнаружен один прототрофный штамм, формирующий прозрачные, типичные для холеры колонии (Р16064 chr:TnphoA-T). Отсутствие продукции капсулы у данного трансконъюганта подтверждено электронной микроскопией. Таким образом получен штамм Vibrio cholerae P16064 chr::TnphoA, который депонирован Государственной коллекцией патогенных бактерий научно-исследовательского противочумного института "Микроб", регистрационный номер КМ138.

Пример, иллюстрирующий уровень антигенности по 0139-антигену штамма КМ138.

Для проверки уровня антигенности штамма КМ138 провели иммунизацию двух групп кроликов (по 5 кроликов в группе) штаммами КМ137 и КМ138. Иммунизацию проводят методом Shimada Т. с соавт. (Shimada Т., Arakawa E., Itoh К. et al. // J. Current Microbiology. 1994. Vol. 29. P. 331-333) убитыми клетками данных штаммов. Каждый штамм засевают в 10 мл LB бульона. После ночной инкубации при 35^oС с продолжительным встряхиванием культуру прогревают при 100^oС в течение 2 часов. После чего культуру центрифугируют при 3000 оборотов в мин в течение 15 мин. Полученный осадок дважды отмывают физиологическим раствором, а затем суспендируют в физиологическом растворе до двойного исходного объема. Полученные взвеси являются антигенами. Данными антигенами внутривенно иммунизируют кроликов с 4-дневным интервалом (0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 4,0). Через 7 дней после последней иммунизации кроликов обескровливают, получают сыворотку и изучают ее титр. Оказалось, что наибольшей антигенностью характеризуются клетки штамма КМ138, о чем свидетельствует более высокий титр реакции агглютинации как капсульных, так и бескапсульных штаммов Р16064 с антисывороткой, полученной против штамма КМ138. Антисыворотка против штамма КМ138 агглютинирует клетки капсульного штамма Р16064 в разведении 1: 1600, а клетки бескапсульного штамма КМ137 - в разведении 1:3200. Титры антисыворотки, полученной к бескапсульному штамму КМ137, следующие: в реакции с капсульным штаммом Р16064 - 1:800, а с бескапсульным штаммом KM137 - 1:1600.

Таким образом, бескапсульный штамм КМ138 из-за более высокой антигенности (превышающей в 2 раза антигенность штамма КМ137) может быть использован при получения холерных диагностических 0139-антисывороток с высоким титром.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению штамма, и может быть использовано для получения холерной диагностической 0139-антисыворотки, а также вакцинных препаратов. Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ 138 серогруппы 0139 обладает высокой антигенностью, о чем свидетельствует высокий титр реакции агглютинации как капсульных (1:1600), так и бескапсульных (1:3200) штаммов серогруппы 0139 с антисывороткой, полученной против штамма КМ 138.

Штамм бактерий Vibrio cholerae КМ 138 серогруппы 0139 - продуцент холерного 0139 антигена.