СПОСОБ ВНЕСЕНИЯ В ПОЧВУ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2002 года по МПК A01C21/00 C05F11/08 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, конкретно к способам внесения в почву бактериальных азотных удобрений под бобовые и злаковые культуры, образующие эффективные азотфиксирующие растительно-микробные комплексы с клубеньковыми и ассоциативными бактериями.

Известен традиционный способ внесения в почву азотфиксирующих бактерий, заключающийся в предпосевной обработке семян бактериальным препаратом на основе штаммов азотфиксирующих бактерий. Например, для обработки семян сои используют ризоторфин - смесь жидкой культуры бактерий с торфом, содержащий 2,5 млд. клубеньковых бактерий на 1 г препарата. Можно использовать также жидкую рабочую культуру бактерий стандартной концентрации, обычно с титром 3-5•10⁹ бак/мл. Обработку семян проводят, в основном, вручную. Для этого на брезент размером 3•4 м насыпают семена на 1-2 га посева, т.е. 100-200 кг, увлажняют водой или раствором прилипателя из расчета 1% к весу семян, перемешивают семена поочередным подниманием концов брезента, опрыскивают раствором бактериального препарата и вновь перемешивают до равномерного распределения препарата на поверхности семян. Обработанные семена в тот же день высевают во влажную почву [1].

В качестве недостатков этого способа можно отметить следующее. Во-первых, необходимо обработать большие массы семян в короткие сроки перед посевом. Предварительная обработка семян до посева невозможна из-за высокой или полной гибели азотфиксирующих бактерий. Например, известно, что клубеньковые бактерии, нанесенные на поверхность семян сои, быстро гибнут: уже через 5-6 часов после обработки количество их уменьшается вдвое. Поэтому, если семена не были высеяны в течение суток, их снова обрабатывают в день посева. Во-вторых, ручная обработка семян трудоемка и малопроизводительна. Существующие машины для протравливания семян не обеспечивают требуемого качества обработки, зачастую механизированная обработка приводит к повреждению семян. Между тем механизация внесения в почву азотфиксирующих бактерий диктуется увеличением посевов бобовых и злаковых культур и необходимостью обработки больших масс посевного материала, составляющего 10-15% от ежегодного урожая.

Задачей изобретения является разработка простого и экономичного способа внесения в почву азотфиксирующих бактерий под бобовые и злаковые культуры, исключающего трудоемкую операцию предпосевной обработки семян бактериальным препаратом и обеспечивающего возможность механизировать процесс внесения бактериальных удобрений на больших площадях и в лучшие биологические сроки.

Поставленная задача решается заявленным способом, согласно которому азотфиксирующие бактерии попадают в почву путем внекорневой обработки вегетирующих растений раствором соответствующего бактериального препарата.

При назначении расхода препарата следует исходить из апробированного правила: успех достигается, если обеспечивается гектарная норма расхода бактерий в пределах 0,5-5•10¹² бак/га, т.е. следует учитывать титр препарата. Например, в способе-прототипе, для обработки гектарной нормы семян сои используют ризоторфин с титром 2,510⁹ бак/г в дозе 200 г. Такая же доза препарата достаточна для внекорневой обработки 1 га вегетирующих растений сои, т. е. гектарные дозы бактериального препарата в известном и заявленном способе практически одинаковы.

Однако по своей сути способы отличаются друг от друга. В способе-прототипе азотфиксирующие бактерии вносятся в почву с семенами, в новом способе - их наносят на вегетирующие растения, исключая этим трудоемкую и малопроизводительную операцию обработки семян перед посевом. Бактериальный препарат в виде рабочего раствора наносят на растения известными методами: опрыскиванием или аэрозолями. Применяя аэрозольную технологию оптимальной дисперсности, можно обрабатывать большие посевные площади в лучшие биологические сроки.

Возможность применения заявленного способа и его достоинства подтверждают следующие примеры.

Пример 1. Вегетационный опыт с соей.

Семена сои сорта Омская 8 выращивались в вегетационных сосудах, вмещающих 7 кг промытого кварцевого песка, прокаленного для создания стерильных условий. В сосуды вносили питательную смесь Прянишникова с 0,1 нормы азота состава (из расчета на 1 кг почвы или 1 л воды): NH₄NО₃ - 24 мг, СаНРO₄ - 172 мг, FеCl₃•6Н₂О - 25 мг, CaSO₄•2H₂O - 344 мг, MgSO₄•H₂O - 123 мг, КСl - 160 мг. Кроме указанных солей, питательная смесь дополнялась раствором микроэлементов. Влажность в сосудах поддерживалась на уровне 70% от полной влагоемкости путем ежедневного полива по массе. В каждый сосуд засевалось по 8-10 семян с последующим оставлением 5 хорошо развитых растений. В опыте с разными вариантами внесения клубеньковых бактерий использован штамм 2940 Bradyrhizobium japonicum из коллекции культур ВНИИ сельхозмикробиологии РАСХН. Повторность вариантов 4-х кратная. В контрольном варианте K₁ семена инокулировались при посеве, т. е. традиционно семена обрабатывались бактериальным штаммом. Во втором контрольном варианте К₂ бактерии не вносились вовсе. В трех опытных вариантах (О₁, O₂, О₃) бактеризация проводилась путем опрыскивания в разные интервалы после всходов. При этом в варианте O₁ опрыскивание производили через неделю после всходов (фаза одного нетройчатого листа). В этом случае бактерии попадали на растения и почву. В варианте О₂ опрыскивание проводилось через 2 недели после всходов (фаза двух листьев, один из которых был тройчатым). В варианте О₃ опрыскивание проведено так же через 2 недели после всходов, но почва в сосудах укрывалась для изоляции от попадания бактерий на почву. Титр бактериального препарата составил 10⁷ бак/мл. Норма расхода жидкого препарата 20 мл/м². Раствор бактериального препарата наносился с помощью ручного опрыскивателя Kwasar.

В процессе опыта обращалось внимание на показатели роста, развития сои, а также фиксировался цвет опытных и контрольных растений как показатель обеспеченности азотом, полученным за счет азотфиксации клубеньков, возникших при разных способах внесения бактерий. По окончании опыта через 2 месяца после посева (15 июня - 15 августа) корни растений отмывались от песка, подсчитывалось количество и биомасса клубеньков, отмечался характер их расположения на корнях в каждом варианте опыта. Анализировалась нитрогеназная (азотфиксирующая) активность ацетиленовым методом. Определялись элементы продуктивности сои (количество и вес бобов), отбирались пробы растений на анализ белка, определяемого по методу Бузун и др. Количественные данные приведены в таблицах 1-4.

При визуальном наблюдении через 48 дней после посева отмечено, что в варианте К₁ - растения нормально развиты, зеленого цвета; в варианте К₂ - цвет листьев растений желтый; в варианте O₁ - растения также зеленого цвета, по виду не отличаются от вида растений в варианте К₁; в варианте О₂ - цвет листьев желтоватый, заметно отличается от зеленой окраски вариантов K₁ и O₁; в О₃ - листья тоже имеют желтый цвет, что свидетельствует о недостатке азота.

Через 55 дней после посадки растения в вариантах O₁, О₂ и О₃ имеют зеленый цвет в отличие от желтых листьев в варианте К₂. Таким образом, если через 48 дней после посадки растения в вариантах О₂ и О₃ имели еще желтый цвет, то уже через неделю листья позеленели, что свидетельствует о поступлении азота от клубеньков, образовавшихся на корнях обработанных растений.

При изучении корневой системы растений сои через 60 дней после посадки обнаружено, что на корнях сои в варианте К₂ клубеньки полностью отсутствовали. Желтый цвет таких растений свидетельствовал о недостатке азота. В варианте К₁ клубеньки образовались на главном корне и обеспечили зеленую окраску растений. В вариантах O₁, О₂ и О₃ клубеньки образовались позднее и на боковых корнях.

Таким образом, характер расположения клубеньков на корнях растений, выросших из инокулированных бактериями семян при посеве, отличался от растений, обработанных бактериями по заявленному способу (через 1-2 недели после всходов в фазе 1-2 листьев). Клубеньки при инокуляции семян располагались на главном корне, при опрыскивании листьев - на боковых корнях, что свидетельствует об их более позднем образовании.

В табл. 1 приведены количественные данные по азотфиксирующей активности клубеньков сои. Клубеньки сои во всех опытных сосудах имели достоверно более высокую нитрогеназную активность. Она на 24-35% выше по сравнению с контролем К₁. Таким образом, азотфиксирующая активность клубеньков сои, образовавшихся при нанесении культуры бактерий при опрыскивании растений в начале вегетации, достоверно выше, чем при инокуляции семян, и тем выше, чем раньше произведено опрыскивание. В наших опытах клубеньки при обработке через 1 неделю после всходов имели более высокую активность по сравнению с растениями, обработанными через 2 недели после всходов.

Более высокая нитрогеназная активность клубеньков в вариантах O₁, О₂ и О₃ объясняется их более поздним образованием. Клубеньки в контроле K₁ ко времени измерения по-видимому, уже прошли пик высокой активности.

В табл. 2 показано количество и вес клубеньков сои по вариантам опыта. При опрыскивании листьев и поверхности почвы (O₁ и О₂) количество и сырой вес клубеньков достоверно больше контроля K₁.

В табл. 3 приведены данные по элементам продуктивности (количество и вес бобов) двухмесячной сои по вариантам опыта. Видно, что во всех опытных вариантах с разными сроками и способами опрыскивания клубеньковыми бактериями количество бобов не ниже, а в варианте с более ранним опрыскиванием O₁ на 37% выше, чем в контроле с традиционной инокуляцией семян при посеве (вариант K₁). Сырой и сухой вес бобов во всех опытных вариантах, за исключением О₃, в 1,6-2 раза превышали контрольный вариант прототипа.

В табл. 4 приведены данные по содержанию белка (% на сухую массу) в листьях бобах (стручках) и клубеньках сои в зависимости от сроков и способов внесения клубеньковых бактерий. Полученные данные отражают динамику накопления и перераспределения белка в экономически важные органы растений. Показано, что в клубеньках содержание белка во всех вариантах было одинаково. В листьях опытных вариантов O₁ и О₂ накапливалось на 2% больше белка, чем в контроле К₁ прототипа. В бобах опытного варианта более раннего срока опрыскивания клубеньковыми бактериями (O₁) накапливалось на 3% больше белка в сравнении с прототипом K₁. B варианте с более поздним сроком внесения бактерий опрыскиванием (О₂) бобы были менее развиты и основная масса белка содержалась в листьях. Данные по варианту О₃ из таблиц 2, 3 и 4 свидетельствуют о неперспективности изоляции почвенного пути проникновения клубеньковых бактерий.

Таким образом, в контролируемых условиях вегетационного опыта надежно установлено, что клубеньковые бактерии, внесенные путем опрыскивания растений, попадают в почву, проникают в корни, образуя азотфиксирующие клубеньки, которые по своей активности, количеству превосходят контрольный вариант с традиционной обработкой семян культурой бактерий при посеве. Функционирование клубеньков способствует увеличению содержания белка в растении, следствие чего является значительное повышение урожая бобов.

Полевые опыты на посевах сои и пшеницы поставлены на делянках, расположенных на опытных полях СибНИИ земледелия и химизации СО РАСХН.

Пример 2. Полевые опыты с соей.

Опыты проводились на делянках площадью 25 м² в 4-7 краткой повторности. Варианты опыта включали:
а) традиционную предпосевную обработку (инокуляцию) семян сои культурой клубеньковых бактерий, аналогичной использованной в вегетационном опыте. Для обработки 10 кг семян сои использовали 50 мл культуры бактерий с титром 10⁹ бак/мл. При таком расходе гектарная норма бактерий (для 100 кг семян) составляет 0,5•10¹² бак/га.

б) внекорневое внесение тех же клубеньковых бактерий путем опрыскивания растений сои в фазе 2-х листьев раствором бактериального препарата с титром 10⁸ бак/мл. Норма расхода препарата 1,0 мл/м², что обеспечивает гектарную норму бактерий 10¹² бак/га. Для получения рабочего раствора бактериальный препарат разбавляли водой в отношении 1:20. Опрыскивание проводили ранцевым опрыскивателем Kwasar при норме расхода раствора 20 мл/м².

в) посев семян без каких-либо обработок (контрольный вариант).

Мерой эффективности полевых опытов служил урожай семян сои. Уборку урожая проводили комбайном Сампо-500 с последующим взвешиванием каждой повторности и отбором проб для определения влажности и сорности семян.

Результаты опытов приведены в таблицах 5 и 6.

В табл. 5 показан урожай сои и масса 1000 зерен во всех 3-х вариантах опыта. Видно, что прибавка урожая семян сои и масса 1000 зерен при внекорневом внесении клубеньковых бактерий больше, чем в других вариантах опыта. Это свидетельствует о снабжении растений дополнительным количеством азота в результате функционирования клубеньков, образовавшихся при опрыскивании растений сои культурой клубеньковых бактерий.

Из табл. 6 видно, что вес клубеньков на 1 растение и вес одного клубенька на опрыснутых делянках больше, чем в контрольном варианте, что согласуется с увеличением урожая сои на опытных делянках. Таким образом, увеличение урожая семян сои и веса клубеньков на обработанных делянках свидетельствует об эффективности заявленного способа внекорневого внесения в почву азотфиксирующих бактерий.

Пример 3. Полевые опыты с пшеницей.

Использовано 3 сорта гексаплоидной мягкой яровой пшеницы: сильной раннеспелой "Новосибирская 22", ценной среднеспелой "Лютесценс 25" и сильной среднеспелой "Новосибирская 89". Полевые делянки имели площадь 25 м² в 4-7 кратной повторности в опыте и контроле.

Для приготовления бактериального препарата применены чистые культуры ассоциативных бактерий 3-х родов: Azospirillum lipoferum 137 (препарат Азорин), Arthrobacter mysorens 7 (препарат Мизорин) и Flavobacterium sp. L-30 (препарат Флавобактерин). Препараты получены из ВНИИ сельхозмикробиологии РАСХН (Санкт-Петербург, Пушкин) и размножены в НПО "Вектор" (Кольцово, Новосибирск).

Опрыскивание делянок выполнено ранцевым опрыскивателем Kwasar при норме расхода рабочей жидкости 20 мл/м². Время обработок - в начале вегетации, в фазе кущения. Норма расхода смеси 3-х штаммов ассоциативных бактерий 1,0 мл/м² с титром 10⁸ бак/мл с добавлением 0,1-0,2 мл/м² 2% раствора солей 6-ти микроэлементов в равных долях: цинка, молибдена, кобальта, бора, марганца и йода для лучшего роста растений и обеспечения нормальных условий функционирования бактерий. Такой расход бактериального препарата обеспечивает гектарную норму ассоциативных бактерий 10¹² бак/га.

Контроль - без обработок.

Результаты опытов определялись по урожаю зерна. Уборка проведена комбайном Сампо-500. Пробы зерна взвешивались, с точностью 50 г сразу после скашивания делянки прямо на комбайне с отбором проб на влажность и сорность. Результаты опытов приведены в табл.7. Варианты опыта включали предшественник по стерне (пшеница по пшенице без удобрений) и по пару. Прибавка урожая пшеницы сорта Новосибирская 22 и Лютесцене 25, опрыснутых ассоциативными бактериями в фазе кущения, - достоверна. По пару прибавки нет.

Сорт Новосибирская 89 оказался невосприимчивым к азотфиксирующим бактериям: прибавки урожая нет и по стерне, и по пару.

Таким образом, внесение азотфиксирующих бактерий по зерновым посевам имеет смысл на бедном фоне, в данном случае по пшеничной стерне без удобрений, и не дает отдачи по паровому полю. Это можно объяснить недостатком азота по зерновому предшественнику, который восполнили внесенные азотфиксирующие бактерии и тем обеспечили прибавку урожая. Посевы пшеницы по паровому полю, по-видимому, невосприимчивы к азотфиксирующим бактериям из-за наличия в почве доступного минерального азота, накопленного в паровом поле.

По литературным данным, публикации с начала 1980 г. [2] известно, что в ассоциативных системах: почва - бактерии - растения, определяющая роль принадлежит растению. Экспериментально установлено на 40 сортах яровых, озимых и твердых пшениц из мировой коллекции ВИР, что только четверть исследованных сортов могли получать азот, поставляемый ассоциативными бактериями. Такая способность обусловлена генетически и связана с признаком nis как у пшеницы, так и у других злаковых культур, в том числе у ячменя, проса, сорго, риса. В условиях полевых опытов способность к ассоциативной азотфиксации различалась у злаковых культур в 8-50 раз. Установлена также зависимость ассоциативной азотфиксации от плоидности пшениц. У диплоидных диких и культурных видов пшениц способность к ассоциативной азотфиксации до 4-х раз больше, чем у тетра- и гексаплоидных форм. Современные сорта - это тетра- и гексаплоидные формы пшениц, поскольку увеличение плоидности сопровождается увеличением урожайности, однако происходит снижение белковости. Тем не менее и у современных сортов гексаплоидных пшениц, нацеленных на получение максимального урожая, не утеряна способность к ассоциативной азотфиксации [3]. По-видимому, стратегия работ по обеспечению злаковых культур "биологическим" азотом заключается в том, чтобы вести селекцию культур на упомянутый признак nis, и вести широкий скрининг сортов, отзывчивых на внесение азотфиксирующих бактерий.

Итак, проведенные вегетационные и полевые опыты по применению заявленного способа на сое и пшенице показали, что внекорневое нанесение азотфиксирующих бактерий на листья и поверхность почвы более эффективно, чем традиционная обработка семян этими бактериями перед посевом. При этом заявленный способ менее трудоемок, его реализация осуществляется с помощью известных и доступных механизированных устройств: опрыскивателей, аэрозольных генераторов. При использовании, например, генератора оптимальной дисперсности [4] можно обрабатывать большие площади (1-5 тыс. га за ночную смену) в лучшие биологические сроки, что делает этот способ экономически выгодным и перспективным.

Литература
1. Рекомендации по рациональному применению ризоторфина под сою на юге Украины. ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии. Симферополь - 1985.

2. Шумный В. К. , Сидорова К.К. и др. - Биологическая фиксация азота. Новосибирск. Наука. Сиб. отд-ние. 1991, с. 271.

3. Черемисов Б.М. Усиление азотфиксации - новое направление в селекции пшеницы и других небобовых полевых культур. Обзор.- Сельскохозяйственная биология, 1988, 6 с. 43-49.

4. Патент РФ 950266, 1993. (A.С. 950266, 1982, БИ 30).

Изобретение предназначено для использования в сельском хозяйстве. Способ включает использование бактериального препарата в дозе, обеспечивающей гектарную норму бактерий в пределах 0,5-5,0•10¹² бак/га. При этом раствор бактериального препарата внекорневым способом вносят на вегетирующие растения. Изобретение позволяет повысить эффективность обработки, а также снизить материальные и трудовые затраты на обработку. 7 табл.

Способ внесения в почву азотфиксирующих бактерий под бобовые и злаковые культуры, включающий использование бактериального препарата в дозе, обеспечивающей гектарную норму бактерий в пределах 0,5-5,0•10¹² бак/га, отличающийся тем, что раствор бактериального препарата внекорневым способом вносят на вегетирующие растения.