Штамм бактерий ВRаDYRнIZовIUм Sp.(НеDYSаRUм) для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский Советский патент 1992 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии. в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур.

До настоящего времени активных и специфичных штаммов Rhlzoblum для усиления симбиотической азотфиксации у копеечника альпийского не было предложено.

Известен и используется для инокуляции лядвенца - кормовой бобовой культуры. произрастающей в ареале распространения копеечника альпийского, штамма Bradyrhizoblum sp. (Zotus) 476.

Однако он не может быть использован в качестве микросимбионта копеечника альпийского, так как не вступает в активный симбиоз с этой культурой.

Целью изобретения является создание штамма Bradyrhlzobium sp. (Hedysarum) для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский.

Клубеньковые бактерии штамма 1406 выделены из клубеньков копеечника альпийского.

Штамм идентифицирован по определителю Берги.

Штамм Bradyrhizobium sp. (Hedysarum) 1406 депонирован в коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 1406.

Штамм 1406 растет на питательных средах следующего состава:

ю со

00

VJ

1.Гороховый агар (г/л): горох 100,0; сахароза 20,0; агар 20,0; рН среды 6.8-7,0.

2.Маннитно-дрожжевой агар (г/л); ман- нит 10,0; К2НР04 0.5; MgSO ix7H20 0,2; NaCI 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; рН среды 6,8-7,0.

3.Маннитно -дрожжевой агар с бромти- молсиним (г/л): маннит 10,0; К2НР04 0,5; MgS04x7H20 0,2; NaCI 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар 15,0; бромтимолсиний 5 мл 0,5%-ного спиртового раствора; рН среды 6,8-7,0.

Культу рал ьно-морфологические признаки.

На косом гороховом агаре с рН 6.8-7,0 при 26-28° С трехсуточная культура имеет форму слегка изогнутых палочек с закругленными концами; величина клеток 1,8-2,4 х 0,6-0,7 мкм, грамотрицательные, до 48 ч подвижные, затем по мере старения к 4 сут - теряет подвижность, монотрихи. Медленнорастущая культура.

Образование специализированных клеток - при старении культуры на гороховом агаре с рН 6,8-7.0 и температурой 26-28°С в возрасте 10 сут и более образуются бактероиды ветвистой формы.

Характеристика роста на плотной среде а) по штриху; б) колонии.

1.Гороховый агар, рН 6,8-7,0, Т 26-28°С.

а)Штрих пятисуточной культуры обиль-. ный, бесцветный, слизистый, стекающий, плоский;

б)колонии появляются на 7-е сутки; на 10-е сутки колонии имеют размер 3--4 мм. отнотипныё, круглые, выпуклые, с ровными краями, слабо растекающиеся, слизистые. S-формы, беловатые.

2.Маннитно-дрожжевой агар, рН 6,8- 7.0, Т 26-28°С;

а)Штрих обильный, бесцветный, слизистый, сильно стекающий;

б)Колонии появляются на 7-е сутки; на 10-е сутки имеют размер 4-5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, растекающиеся, слизистые, S-формы, беловатые.

3.Маннитно-дрожжевой агар с бромти- молсиним, Т 26-28°С, рН 6,8-7,0.

а)Штрих обильный, желтоватый, слизистый, сильно стекающий;

б)Колонии появляются на 7-е сутки; на 10-е сутки имеют размер 4-5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, растекающиеся, слизистые, S-формы. желтоватые, среда желтоватая.

Рост в жидкой среде. Молоко с лакмусом, Т - 26-28°С - среду не пептонизирует, подщелачивает. Начиная со вторых суток, окраска изменяется в сторону синего спектра, максимальное изменение окраски молока отмечается на 15-е сутки. На поверхности лакмусового молока через 3 сут образуется слизистая прозрачная зона, которая достигает максимальных размеров 10 мм через 15 сут.

Физиолого-биохимические свойства.

Микросимбионт. Микросимбионт - бо- 0 бовое растение копеечник альпийский.

Отношение к:

а)кислороду - аэроб

б) Т максимальная 40°С

минимальная 10° С 5 оптимальная 26-30°С

с) рН максимальная 7.5

минимальная 5,0

оптимальная 6,8-7,0

Источники углерода: 0Де

ГлюкозаАк (-)

ГалактозаАк (-)

СахарозаАк (-)

ЛактозаАщ (-)

5 МаннитАк (-)

СорбитАк (-)

РамнозаАк (-)

КсилозаАк (-)

МальтозаАк (-)

0 Клетчатка

Крахмал

Жидкая среда Норриса, Т 26-28°С.

Источники азота

NaNOa+

5 (NH4)2S04+

Тирозин+

МПА

Азот фиксирует в симбиозе с копеечником альпийским.

0 Другие характерные физиологические особенности обмена.

Воздействие на диагностические субстраты: желатину не разжижает. Штамм не патогенен.

5 Штамм 1406 хранится на бобовом агаре указанного выше состава рН 6,8-7,0 при 4°С и пересеивается один раз в 6 мес.

Оценку симбиотических свойств штамма 1406- вирулентности, азотфиксирующей 0 активности и эффективности, симбиоза - проводят в условиях микровегетационных и вегетационных опытов.

Вирулентность определяют по количеству и морфологии клубеньков, образован- 5 ных при инокуляции копеечника альпийского, опытными штаммами клубеньковых бактерий.

Азотфиксирующую активность определяют по величине активности нитрогеназы. В свою очередь нитрогеназную активность

измеряют ацетиленовым методом (по редукции ацетилена) на интактных растениях.

Эффективность симбиотической азот- фиксации определяют по общему накоплению азота растениями на сосуд, а также по величине урожая зеленой массы копеечника альпийского и содержанию в ней азота, который определяют с помощью системы Кьельтек-ауто-Текатор (Швеция).

Пример 1. Микровегетационный опыт.

В большие пробирки с 5 г стерильного вермикулита добавляют 11 мл среды Кра- сильникова-Кореняко следующего состава, г/л: К2НРСМ 1,0; MgS04x7H20-1,0; Саз(Р04),2; 1 мл смеси микроэлементов по прописи М.В. Федорова, г/л: НзВОз 5,0; (NH4)2Mo04 5.0; KJ 0.5; NaBr 0,5; ZnS04x7H20 0,3; AI2(S04)3x18H20 0,3; MnS04 0,2; CuS04 0,2. Стерилизуют в автоклаве. Семена копеечника альпийского ви- дообразца из ВИЛР скарифицируют и стерилизуют концентрированной серной кислотой в течение 3 мин, промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной водой бумажные фильтры в чашках Петри для прорастания. Через двое суток проращивания в асептических условиях раскладывают в пробирки со средой (по 2 проростка). Опыты ставят в 10-ти кратной поверхности. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивают на косом гороховом агаре в пробирках в течение 3 сут при 28°С и суспендируют в растворе микроэлементов. Через двое суток после посева семян в каждую пробирку с растениями вносят по 1 мл инокулюма, имеющего концентрацию 107 клеток в 1 мл. Растения выращивают в фитотроне при 22-24°С. Через 48 дней пробирки герметично закрывают и вводят шприцом ацетилен до концентрации 10% по объему. Количество этилена, образовавшегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназной клубеньковых бактерий, определяют через 24 ч на газовом хроматографе Цвет- 100. Величину нитрогеназной активности клубеньков, которая характеризует азотфиксирующую активность штаммов, выражают в микромолях СзН4 за 24 ч на сосуд. Результаты представлены в табл. 1.

Как показывает табл. 1, бактерии предлагаемого штамма 1406 вирулентны на копеечнике альпийском: они образуют на его корнях типичные для этого растения клубеньки, а бактерии известного штамма 476 в этих условиях слабовирулентны: образуют белые, мелкие клубеньки не на всех растениях.

Штамм 1406 является активным азот- фиксирующим микросимбионтом копеечника альпийского: нитрогеназная активность клубеньков, образованных бактериями это- 5 го штамма на копеечнике альпийском, на 3 порядка выше, чем у растений, инокулиро- ванных штаммом 476.

Нитрогеназная активность копеечника альпийского, инокулированного штаммом 10 476, была на уровне контрольных растений, следовательно, бактерии этого штамма не обладают азотфиксирующей активностью в симбиозе с данной бобовой культурой.

Результаты микровегетационного 15 опыта по определению общего накопления азота копеечником альпийским, бактеризованным вышеупомянутыми штаммами, представлены в табл. 2.

Как показывают данные этой таблицы, в 0 результате активной фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями штамма 1406 в симбиозе с копеечником альпийским улучшалась обеспеченность растений азотом, благодаря чему общее 5 накопление азота в них было на 124% выше, чем при использовании штамма 476. При этом урожай зеленой массы растений, инокулированных штаммом 1406, повысился на 36,2%, а содержание азота в ней 0 на 1.25%.

В клубеньках растений, инокулированных штаммом 476, симбиотическая азотфиксация отсутствовала, растения дополнительно не снабжались азотом из воз- 5 духа, в результате продуктивность копеечника альпийского в этом варианте не увеличилась.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что активная симбиотическая 0 азотфиксация у копеечника альпийского может быть получена только при онокуля- ции специфичными для него штаммами клубеньковых бактерий. Ввиду этого в дальнейшем опыты штамм 476 не включал- 5 ся.

Пример 2. Вегетационный опыт проводили в сосудах с 6 кг дерновоподзоли- стой почвы с внесением солей по прописи Прянишникова, но без азота, г/кг почвы: KCI 0 0.15; MgS04 0,06; СаНРСМ 0,172; MnSU4 0.003; борная кислота 0,003 (NH MoO/i 0,001. Повторность опыта 4 кратная. Использовали семена копеечника альпийского видообразца из ВИЛР. Для инокуляции 5 семян использовали чистую культуру бактерий на скошенном гороховом агаре. Культуру в пробирках с титром 4-5 млрд смывали водопроводной водой, затем суспензию наносили на семена копеечника альпийского, разложенные в лунки, еделанные в почве каждого сосуда. В сосуд вносили 108 клеток.

Данные по эффективности инокуляции копеечника альпийского в вегетационном опыте штаммом 1406 представлены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что штамм 1406 вступает в эффективный симбиоз с копеечником альпийским, усиливает у него процесс симбиотической аэотфиксации и благодаря этому свойству способен увеличивать продуктивность растения-хозяина: урожай зеленой массы повысился на 124,4%, содержание азота в растениях на 1,02%.

Пример 3. Получение препарата на основе штамма 1406.

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах или пятилитровых бутылях в течение 2 сут на среде следующего состава, мас.%: гороховый отвар 10,0; сахар (пищевой) 1,0; (NH4)2S04 0,5; КН2Р04 0.05; К2НР04ХЗН20 0.05; MgS04x7H2O 0,02; СаСОз 0,1; вода водопроводная до 100.0; рН после стерилизации (1,0 эти, 30 мин) 6.8-7,0. Титр клеток 4-5 млрд/мл. Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в пятилитровых бутылях или ферментаторах на среде следующего состава, мас.%: кукурузный экстракт 1; меласса 2,0; (NN4)2804 0,1; КН2Р04 0,025; К2НР04ХЗН20 0,025, MgS04x7H200,02; СаСОзО.1; вода водопроводная до 100,0; рН после стерилизации 6,8-7,0.

Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутыли встряхивают на качалке в течение 48-60 ч. В ферментаторах бактерии выращивают 36-48 ч при 28-30°С. Титр 4-5 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей или ферментаторов - инокулюм - используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низин- ный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0, с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200-400 г стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрзд Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральная жидкость + меласса (6%) из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,3-0,5 торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в Специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое. Культуру в торфе подращивают, выдерживая пакеты 3-5 сут при 15-20°С. Ризоторфин хранят при 3-8°С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин для копеечника альпийского на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового препарата 50-55%. Ризоторфин содержит 3-4 млрд клубеньковых бактерий на 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.

Пример 4.

Конкретное использование штамма в полевых условиях.

Влияние штамма 1406 на урожай копеечника альпийского изучают в полевом опыте на дерново-подзолистой почве. Площадь делянки 20 м2. повторность опыта 4-кратная. Вносят минеральные удобрения

P120K120.

Используэт семена копеечника альпий- ского. Семена обрабатывают торфяным препаратом-ризоторфином, изготовленным на предлагаемом штамме. Доза препарата 200 г на гектарную норму семян, титр препарата 4 млрд/г.

- Способ внесения препарата: 200 г ризо- торфина разводят в 1,0 л водопроводной воды и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем семена тщательно перемешивают для равномерного распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена высевают в тот же день во влажную почву.

Эффективность симбиотической азот- фиксации штамма 1406 с копеечником альпийским определена по величине урожая зеленой массы растений так называемого лекарственного сырья, куда входят листья, тонкие стебли, бутоны и цветы, а также по содержанию белка в сырье.

Штамм 1406 является видоспецифич- ным по отношению к копеечнику альпийскому, по сравнению с ранее описанным, т. е. известный штамм не вступает в эффективный симбиоз с копеечником альпийским. Поэтому в полевом опыте было лишь два варианта: контроль, где растения могли инфицироваться природной популяцией ризо- бий, и вариант с инокуляцией штаммом 1406.

Данные табл. 4 показывают, что штамм 1406 является высокоэффективным симбио- тическим азотфиксатором. Улучшение азотного питания копеечника альпийского за счет более интенсивного поступления биологического азота оказывает положительное влияние как на урожайность растения-хозяина, так и на его качество. Урожай зеленой массы копеечника альпийского при инокуляции этим штаммом повышается на 6,9 ц/гз или на 109,5%. Штамм улучшает качество урожая за счет значительного повышения содержания в нем белка на 7,9 %.

Таким образом штамм Bradyrhlzobium sp. (Hedysarum) 1406 существенно увеличивает азотфиксирующую активность копеечника альпийского, повышает его продуктивность, что указывает на то, что предлагаемый штамм является активным

азотфиксирующим микросимбионтом копеечника альпийского и может быть использован для получения бактериального удобрения под это растение.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bradyrhlzobium sp. (Hedysarum) ВНИИСХМ 1406 для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский.

Таблица 1

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур. Целью изобретения является создание штамма Bradyrhizoblum sp. (Hedysarum) для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский. Штамм бактерий Bradyrhizoblum sp. (Hedysarum) выделен из клубеньков копеечника альпийского, депонирован во ВНИИСХМ Мг 1406 (для получения бактериального удобрения под копеечник альпийский). Штамм позволяет увеличить урожай зеленой массы копеечника альпийского на 6,9 ц/га или на 109,5% по сравнению с контролем. Штамм улучшает качество урожая за счет значительного повышения содержания в нем белка на 7,9%. 4 табл. ч- Ё

Вирулентность и азотфиксирующая активность штаммов 1406. 476

р-4.3%.

НСРо.95

0,30 мкмоль/сосуд Таблица 2

Эффективность симбиотической азотфиксации штаммов 1406 и 476

р 3,0 %; HCPos 2.2 мг/сосуд

Таблица 3

Эффективность симбиоза штамма 1406 с копеечником альпийским

НСРо.95

11171938712

Таблица 4

/

Влияние штамма 1406 на урожайность копеечника альпийского