Штамм бактерий ВRаDYRнIZовIUм Sp. (VIGNa) для получения бактериального удобрения под @ маш Советский патент 1992 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур.

Известен штамм Rhizoblurn phaseolt 696, который используют для инокулйции фасоли обыкновенной. Однако штамм; 636 не может быть использован в качестве микросимбиоита маша, так как он не Уступает в активный симбиоз с этой культурой. :

Целью изобретения является создЭние штамма Bradyrhizoblum sp. дпя получения бактериального удобрения под маш.

Клубеньковые бактерии шт. 1901 выделены из клубеньков маша.

Штамм определен по определителю Берги. ,

Шт. Bradyrhlzoblum sp. (Vlgna) 1901 депонирован в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под Nfe 1901.

Шт. 1901 растет на питательных средах следующего состава:

1.Гороховый агар, г/л: горо 100,0: сахароза 20,0; агар 20,0; рН 6,8-7,0.

2.Люпиновый агар, г/л: k2HP04-Oi5; КН2Р04-0,5; HgS04x7H20 - 0.2; NaCI -0,2; CaS04 - 0,1; (NH4)2Mo04 - следы: маннит 20,0: люпиновая мука - 10,0: агар- 20,0; рН 6,8-7.0.

3.Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит- 10.0; К2НР04 0,5; MgSO4x7H20 - 0,2: NaCI - 0,1; дрожжевой экстракт - 0,4; агар 15.,01рН-6,8-7,0,

Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки. На косом маннитно-дрожжевом агаре с РН 6,8-7.0 при 26-28°С в пятисуточной

культуре имеют форму слегка изогнутых палочек с закругленными концами, размер 2,4-3,6x0,7-0,8 мкм, грамотрицательные, до 72 ч подвижные, затем по мере старения к5 суткам -утрачивают подвижность, монотрихи. Медленнорастущая культура.

Образование специализированных клеток.

При старении культуры на люпиновом агаре с рН 6,8-7,0 и при 26-28°С в возрасте 10 сут и более образуются бактероиды ветвистой формы.

Характеристика роста на плотной среде.

1.Люпиновый агар, Т - 26-28 С, рН 6,8-7,0

а)Штрих 5-суточной культуры умеренный, белый, слизистый, слабовыпуклый, блестящий.

б)Колонии появляются на 7-е сутки; на 10-е сутки колонии имеют размер 1-1,5 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, белые.

2.Маннитно-дрожжевой агар, Т -2628 0, рН 6,8-7,0

а)Штрих 5-суточной культуры обильный, беловатый, стекающий.

б)Колонии появляются на 7-е сутки; на 10-е сутки имеют размер 1-2 мм, однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, беловатые.

3.Гороховый агар, Т - 26-28°С, рН 6,87,0

а)Штрих на гороховом агаре скудный. Эта среда используется для получения колоний,

б)Колонии появляются на 7-е сутки; на 10-е сутки имеют размер 1-1,5 мм. однотипные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистые, S-формы, белые.

Рост 8 жидкой среде.

Молоко с лакмусом, Т -26-28°С, не пептонизирует, подщелачивает. После 48 ч окраска молока изменяется в сторону синего спектра, максимальное изменение цвета отмечается на 15-е сутки.

Физиолого-биохимические свойства.

Симбионт.

Макросимбионт-бобовое растение маш.

Отношение к;

а)кислороду - аэроб;

б) Т° максимальная 40°

минимальная 10°

оптимальная 26-28°

с) рН максимальный 8.0

минимальный 6.0

оптимальный 6.8-7,0

Источники углерода д е

ГлюкозаАщ (-)

ГалактозаАщ(-)

СахарозаАщ(-)

ЛактозаАщ(-)

МаннитАщ(-)

СорбитАщ(-)

РамнозаАщ(-)

КсилозаАк(-)

МальтозаАщ(-)

ДекстринАщ(-)

0 Клетчатка

КрахмалЖидкая среда Норриса, Т - 26-28°С

Источники азота ЖNaNDs+

5(NH4)2S04+

Тирозин +

МПА Азот фиксирует в симбиозе с машем.

Другие характерные физиологические 0 особенности обмена.

Желатину не разжижает, .

Штамм не патогенен.

Штамм 1901 хранится на люпиновом агаре указанного выше состава, рН 6,8-7,0. 5 при и пересевается один раз в 6 мес.

Оценку симбиотических свойств штамма 1901:вирулентности, азотфиксирующей активности и эффективности симбиоза проводят в условиях микровегетационных и ве0 гетационных опытов.

Вирулентность определяют по количеству и морфологии клубеньков, образованных при инокуляции маша клубеньковыми бактериями.

5 Азотфиксирующую активность определяют по величине активности нитрогеназы. В свою очередь нитрогеназную активность измеряют ацетиленовым методом (по редукции ацетилена) на интактныххлубеньках. 0 Эффективность симбиотический азотфиксации определяют по общему накоплению азота растениями на сосуд, а такжэ по величине урожая зеленой массы маша и содержанию в ней азота, который определяют 5 с помощью системы Кьельтек-ауто Текатор (Швеция).

П р им е р 1. Микровегетационный опыт.

В большие пробирки с 6 г стерильного вермикулита добавляют 19 мл среды Кра0 сильнйкова-Кореняко, г/л; К2НР04 - 1,0; MgS04x7H20 -1,0; Саз(Р04)2 -0,2; NN48030,024 (0,1 нормы): смеси микроэлементов по М.В.Федорову - 1 мл (НзВОз - 5.0; (NH4)2Mo04 - 5,0; KJ - 0,5; NaBr - О.Б; 5 ZnS04x7H20 - 0,3; Al2(S04)3x18H20 - О.Зг MnS04 - 0,2, Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве. Семена маша.стерилизуют 0.5%-ным раствором сулемы в течение 1 мин. промывают стерильной водой и раскладывают на увлажненные стерильной водои бумажные фильтры в чашках Петри для прорастания. Через двое суток проростки в асептических условиях раскладывают по одному в пробирки со средой. Опыты ставят в 10-кратной повторности. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивают на косом люпиновом агаре в пробирках в течение 5 сут при 28°С и суспендируют в растворе микроэлементов. Через 5 сут после посева семян в каждую пробирку вносят 1 мл инокулюма, имеющего концентрацию 10 клеток. Растения выращивают в фитотроне при 22-24°С. Через 34 сут корни растений с клубеньками отмывают водопроводной водой и отдельно с каждого растения помещают в реакционный флакон емкостью 50 мл, который закрывают резиновой пробкой, завинчивают пластмасс о вой крышкой с просв ерленными отверстиями. Во все флаконы через отвёрстие в крышке шприцем вводят.5 мл ацетилена. Экспозицию с ацетиленом корней с клубеньками проводят при 26°С. Через :2 ч реакцию останавливают введением 2 мл реактива Несслера. Количество этилена, образовавшегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяют через сутки на газовом хроматографе Цвет 100. Величину нитрогеназной активности клубеньков, которая; характеризует азотфиксирующую а:ктивность штамма, выражают в микромолях С2Н4 за 1ч на 1 растение.

Результаты представлены в табл.1.

Данные табл.1 показь1вают, что бактерии штамма 1901 вирулентны на маше: они образуют на его корнях типичные для этого растения клубеньки; бактерии штамма 696 не образуют клубеньки на этом бобовом растении, т.е. они невирулентны на маше.

Штамм 1901 является активным азотфиксирующим микросимбионтом маша: нитрогеназная активность клубеньков образованных бактериями этого щтамма на растении - хозяине, на 3 порядка выше, чем у контрольных растений и растений, инокулированных штаммом 696.

Результаты микровегетационных опытов по определению общего накоплемия азота растениями маша, бактеризова нными вышеупомянутыми штаммами, представлены в табл.2.

Как показывают данной этой таблицы, в результате активной фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями штамма 1901 в симбиозе с машем улучшалась обеспеченность растений азотом, благодаря чему общее накопление азота в них было на 374,7% выше, чем при использовании штамм 696. При этом урожай зеленой Maicсы растений, инокулированных штаммом 1901, повысился на 56,64, а содержание азота в ней на 1,46%.

В растениях, инокулированных штаммом 696, симбиотическая фиксация азота атмосферы отсутствовала, растения дополнительно не снабжались азотом из воздуха. в результате продуктивность маша в этих вариантах не увеличивалась.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что активная симбиотическая азотфиксация у маша может быть получена только при инокуляции специфичными для него штаммами клубеньковых бактерий. Ввиду этого в дальнейшие опыты известный штамм не включался.

П р и м е Р 2. Вегетационные опыты проводят в сосудах с 6 кг дерновоподзолистой почвы с внесением солей по прописи Прянишникова, г/кг почвы: КС1 - 0,15; MgS04 - 0,06; СаНРОА - 0,172; MnS04 0,003; борная кислота - 0,008; (NN4)2 Мо04 -0.001; NH4N03-0,024 (0,1 нормы). Повторность опыта 4 кратная. Использовали .семена маша сортообразца из Узб.ССР (Коллекция ВИР) с машем.

Для инокуляции семян чистую культуру бактерий выращивают на скошенном люпиновом агаре в течение 5 сут. Культуру в пробирках с титром 4-6 млрд, кл смывают водопроводной водой, затем суспензию наносят на семена маша, разложенные.в лунки, сделанные в почве каждого сосуда. В сосуд вносят .

Данные влияния инокуляции маша штаммом 1901 на его продуктивность приведены в табл.3.

Из этой таблицы следует, что штамм 1901 вступает в эффективный симбиоз с машем, усиливает у него процесс симбиотической азотфиксации и благодаря этому свойству способен увеличивать продуктивность растения-хозяина; урожай зеленой массы, повышается на 128,1%, содержание белка в растениях на 11,2%.

Примерз. Получение препарата на основе штамма 1901.

Приготовление жидкой посевной культуры.

Жидкую культуру выращивают на качалке в качалочных колбах и пятилитровых бутылях в течение 3-4 суток на среде следующего состава (мас.%): гороховый отвар - 10,0; глюкоза - 0,5; сахар пищевой - 0,5; (NH4)2S04 - 0,05; КН2Р04 - 0,05; К2НР04ХЗН20 - 0,05; MgS04x7H20 - 0,02; СаСОз (стерильный) - 0,03; вода водопроводная-остальное. рН после стерилизации

6,3-6,6. Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин. Титр бактерий 4-5 млрд/мл.

Посевную культуру используют для получения жидкой .рабочей культуры. Ее готовят в пятилитровых бутылях или ферментаторах на среде следующего состава, мас.%: кукурузный экстракт-1,0; пекарские дрожжи (влажные) - 0,05; меласса -1,0; глюкоза - 0,5; (NH4)2S04 - 0.1; КН2Р04 - 0,025; К2НР04ХЗН20 - 0,25; MgS04x7H20 - 0,02; СаСОз - 0,1; вода водопроводная - остальное; рН после стерилизации 6.2-6,5.

Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%. Бутылки встряхивают на качалке в течение 72-96 ч. В ферментаторах бактерии выращивают в течение 36-48 ч при ступенчатой аэрации 0,2-0,1 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 атм при 2830°С. Титр не менее 5 млрд/мл. После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей и ферментаторов инокулюм - используют для смешивания с торфом.

Подготовка торфа.

Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0 с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200400 г, стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: Культуральная жидкость + меласса (3%) из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,15-0,8 млрд/г торфа и влажности 45-60%. Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемещается их содержимое. Ризоторфин хранят при 1015°С в темном сухом помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин Для маша на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового продукта 50-55%. Ризоторфин содержит 3-4 млрд бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную норму семян.

П р и м е р 4. Конкретное использование штамма 1901 в полевых условиях.

Эффективность симбиотической азотфиксации штамма 1901 определена в полевом опыте по величине урожая зерна

содержанию в нем белка. Почва опытного участка - орошаемые сероземы, площадь делянки 10м; повторность опыта 4-кратная. Вносили минеральные удобрения РбоКео.

Использовали семена маша. Семена обрабатывали ризоторфином, изготовленным на основе штамма 1901.

Доза препарата 200 г на гектарную норму семян, титр препарата 3 млрд/г. Способ

0 внесения препарата; 200 г ризоторфина разводят в 1 л водопроводной воды и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектариую норму семян. Затем семена тщательно перемешивают для равномерного

5 распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена высевают в тот же день во влажную почву.

Штамм 1901 является видеоспецифичным по отношению к машу, по сравнению с

0 ранее описанным, т.е. известный штамм не вступает в эффективный симбиоз с машем. Поэтому в полевом опыте было лишь два варианта: контроль, где растения могли инфицироваться природной популяцией ризо5 бий и вариант с инокуляцией штаммом 1901

(табл.4).

Данные табл.4 показывают, что штамм

1901 является высокоэффективным симбиотическим азотфиксатором, Улучшение азотного питания инокулированных растений маша сортообразца из УзССР (Коллекция ВИР) за счет более интенсивного поступления биологического азота оказывает положительное влияние как на урожайность

5 растения-хозяина, так и на его качество. Урожай зерна маша при бактеризации этим штаммом повышается на 3,4 ц/га или на 33,3%. Штамм улучшает качество зерна за счет повышения содержания в нем белка на

0 2,8%.

Таким образом, штамм Bradyrhizoblum sp. (Vigna) 1901 существенно увеличивает азотфиксирующую способность маша, повышает его урожай и улучшает качество урожая за счет увеличения в нем белка. Это указывает на то, что штамм является активным азотфиксирующим микросимбионтом маша и может быть использован для получения бактериального удобрения.:

Формула изобретения Штамм бактерий Bradyrhlzobium sp. (VIgna) ВНИИСХМ 1901 для получения бактериального удобрения под маш.

9171234810 Вирулентность и азотфиксирующая активность штаммов 1901 и 696.

Т а б л и ц а 1

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, вчастности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур. Целью изобретения является создание штамма Bradyrhlzpblum sp. для получения бактериального удобрения под маш. Штамм бактерий Bradyrhizoblum sp. (VIgna) выделен из клубеньков маша, депонирован во ВНИИСХМ Мг 1901. Штамм позволяет увеличить урожай зерна маша на 3,4 ц/га или на 33,3% по сравнению с контролем. Штамм улучшает качество зерна за счет повышения в нем белка на 2,8%. 4 табл.•слс

Эффективность симбиотичёской азотфиксации штаммов 1901 и

Эффективность симбиоза штамма 1901 машем.

Таблица 2

Таблица 3

Эффективностьштамма в полевом опыте с машем

Таблица А