СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР Российский патент 2006 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области физиологии растений.

В настоящее время при получении трансгенных растений зерновых культур метод агробактериальной трансформации не нашел широкого применения, т.к. в природе они не чувствительны к агробактериям. Для получения трансгенных растений зерновых культур в основном используют методы "прямого" переноса генов.

Один из широко используемых методов - это метод баллистической трансформации, который основан на переносе различных генов с использованием специальной установки, основанный на неестественном (на химически инертных металлы наносятся вводимые гены, которые внедряются в клеточные структуры под давлением) проникновении в клетки растений за счет поранения клеточной стенки. Этот метод используют для получения трансформированных растений кукурузы (Brettschneider R., Becker D., Lorz H. Efficient transformation of scutellar tissue of maize embryos. // Theor Appl Genet. 1997. v.94. p.737-748). Для пшеницы {Becker D., Brettschneider R., Lorz H. Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of sctellar tissue. // Plant J. 1994. v.5. p.299-307}. Для ячменя [Wan Y., Lemaux P.G. Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants. // Plant Physiol. 1994. v.104. p.37-48].

Недостатки этого способа - ограничение размера вводимых генетических конструкций, возможное их разрушение, а также неконтролируемое число копий вводимого гена. Еще недостатком этого метода является высокая частота появления неполноценных трансформированных растений.

Известен способ вакуумной обработки проростков кукурузы в суспензии агробактерии, после чего была обнаружена экспрессия введенного гена (Shen W.H., Escudero J., Schlappi M., Ramos С., Hohn В., Koukolikova Z.N. T-DNA transfer to maize cells: histochemical inves tigation of β-glucuronidase activiti in maize tissues. //Ploc-Nafl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P.1488-1492).

Недостатком этого способа обработки является то, что в конечном результате показана транзиентная экспрессия вводимого гена гистохимическим окрашиванием, но не показано его наследование.

Известен метод получения трансформированных растений зерновых культур - кукурузы, ячменя и пшеницы за счет прямого введения чужеродных генов в протопласты. Для кукурузы (Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. // Nature. 1986. v.319. p.791-793). Для ячменя [Lazzeri P., Brettschneider R., Luhrs R., Lorz H. Stable transformation of barley via PEG-induced direct DNA uptake into protoplasts. // Theor. And Appl. Genet. 1991. v.81 p.434-437]. Для пшеницы {Не D.G., Mouradov A., Yang Y.M. et al. Transformation of wheat hrough electroporation of protoplasts. // Plant Cell Rep. 1994. v.14. p.192-196}.

Недостатком этого способа является сложность получения регенерантов из протопластов, кроме того, при культивировании протопластов in vitro высока вероятность появления сомаклональных вариаций.

Известен способ получения трансформированных растений зерновых культур, заключающийся в кокультивировании незрелых зародышей с агробактериями, предварительно обстрелянными частичками золота для ячменя [Tingay S., McElroy D., Kalla R., Fieg S., Wang M., Thoronton S., Brettell R. Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation // Plant J. 1997. v.11. p.1369-1376]. Или для поранение клеточных стенок эксплантов использовали силиконово-карбитные волокна, с последующим культивированием и регенерации, для кукурузы (Frame B.R., Drayton P.R., Bragnall S.V., et al. Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker - mediated transformation. // Plant J. 1994. v.6 р.941-948). Для пшеницы {Singh N., Chawla H.S. Use of silicon-carbide fibers for agrobacterium-mediated transformation in Wheat. // Current Science - 1999 - v.76 - p.1483-1485}.

Недостатком этого способа является невысокий выход полноценных трансформированных растений при больших затратах растительного материала и энергоемкого оборудования.

Известен способ получения трансформированных растений кукурузы, заключающийся в кокультивировании незрелых зародышей кукурузы с агробактериями, предварительно обработанными ацетосирингоном, с последующем встряхиванием на приборе "vortox" и культивированием на твердой питательной среде, содержащей антибиотики (Ishida Y., Saito Н., Ohta S., Hiei Y., Komari Т., Kumashiro Т. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. // Nat. Biotechnology. 1996. V.14. P.745-750).

Недостатком этого способа является малый выход трансформированной кукурузы, нестабильность воспроизводимости результатов, использование в качестве эксплантов только незрелых зародышей и нетехнологичность процесса.

Один из близких по технической сущности и достигаемому эффекту является способ обработки эмбриогенного каллуса кукурузы in vitro, который обеспечивает увеличение регенерации из эмбриогенного каллуса кукурузы в 5-10 раз, способствует ускоренной дифференцировке каллусных структур в 3-4 раза за счет повышения частоты регенерации, а также обеспечивает регулируемость и контролируемость процесса регенерации. Без всех вышеперечисленных условий невозможна успешная трансформация кукурузы, когда в качестве эксплантов используют эмбриогенный каллус. Сущность способа обработки эмбриогенного каллуса кукурузы in vitro, заключается в культивировании эмбриогенного каллуса кукурузы на питательной среде, содержащей антибиотик цефотаксим, который добавляют в момент, необходимый для получения регенерантов, в концентрации 100-300 мг/л (Данилова С.А, Долгих Ю.И. Способ обработки эмбриогенного каллуса кукурузы in vitro. Патент РФ №2200760. опубл. 20.03.2003. Бюл. №8).

Недостатком этого способа является то, что он применим только для эмбриогенного каллуса.

Самым близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения трансформированных растений кукурузы in vitro, заключающийся в кокультивирование эксплантов кукурузы на газоне агробактерий, предварительно активизированными экссудатом табака, в течение одного пассажа культивирования, в качестве эксплантов используют как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус, а добавление антибиотиков проводят поэтапно, сначала цефотаксим в течение шести пассажей в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений (Данилова С.А, Долгих Ю.И. Способ получения трансформированных растений кукурузы in vitro. Патент РФ №2196421. опубл. 20.01.2003. Бюл. №2).

Недостатком этого способа является ограничения в использовании растений зерновых культур, отсутствие стабильно воспроизводимых результатов, недостаточный выход трансформированных растений кукурузы, эффективность использования растительного материала и недостаточная его технологичность.

Задачей настоящего изобретения является разработка такого способа, который будет лишен вышеуказанных недостатков и обеспечит: увеличение выхода трансгенных растений, стабильность воспроизводимых результатов, а также позволит использовать в качестве эксплантов как эмбриогенный каллус, незрелые зародыши, так и зрелые зародыши, что позволит эффективно использовать растительный материал и улучшить его технологичность.

Эта задача решается новым способом получения трансформированных растений зерновых культур, заключающимся в обработке эксплантов вакуумной инфильтрацией при - -1,0÷-0,6 атм в течение 15-60 минут в суспензии агробактерий Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, содержащей плазмиду рВ1121 с геном неомицинфосфотрансферазы II (npt II) и геном β-глюкуронидазы (uidA), вакуумной инфильтрацией, с последующим кокультивировании эксплантов растений кукурузы линии 91 (Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б., Жданова Н.Е., Пустовойтова Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэтиленглюколя клеточных линий. // Физиология Растений - 1994 - т.41 - №6 - с.853-858), ячмень (сорт Golden Promise), пшеница (сорт Таежная), на питательной среде с газоном агробактерий, предварительно активизированных экссудатом табака, используя при этом обработку антибиотиком цефотаксимом в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений.

Заявляемые пределы режимов вакуумной инфильтрации определяются следующим образом: использование режимов - 0,6 атм обработки меньше 15 минут резко снижается выход канамициноустойчивых регенерантов, а при - 1,0 атм больше 60-минутной обработки вакуумной инфильтрацей подавляется регенерационная способность эмбриогенного каллуса, а для зародышей снижается образование полноценных растений.

Сущность изобретения, по мнению авторов, заключается в том, что в предлагаемом способе при понижении давлении воздух, находившийся в межклеточном пространстве растительных эксплантов, выходит, а после возвращения к нормальному давлению вместе с молекулами воздуха в межклеточное пространство поступает суспензией агробактерий. Таким образом, создаются лучшие условия для контакта агробактерий с растительными клетками, а последующая культивация эксплантов на газоне агробактерий обеспечивает стабильный выход канамициноустойчивых растений. При этом в качестве эксплантов можно использовать как эмбриогенный каллус, так и незрелые 10-15-дневные зародыши, из которых идет морфогенез с последующим культивированием и регенерацией, а также зрелые зародыши, начиная с 15-20 дня после опыления - исключающие стадию морфогенеза.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Результаты, представленные в примерах 1-45, являются стабильно воспроизводимыми и математически усредненными и представлены в таблице 1.

Пример 1. Эмбриогенный каллус морфогенной линии кукурузы обрабатывают в суспензии агробактерий посредством вакуумной инфильтрации при -0,6 атм в течение 15 минут с последующей культивацией на газоне агробактерий, активизированными экссудатом табака, в течении одного пассажа культивирования, с поэтапным добавлением антибиотиков: сначала цефотаксим в концентрации 200 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений.

Для подтверждения трансформации использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для этого выделяли тотальную ДНК из проверяемых растений фенольным методом (Драйпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. (Ред.) Генная инженерия растений. М.: Мир, 1991. 408 с.). Для ПЦР анализа гена npt II использовали следующие праймеры:

225-1[5'CGACGTTGTCACTGAAGCG3']

225-2[5'AAGCACGAGGAAGCGGTCAG3']

Реакционная смесь содержала: по 2 мкл дНТФ (5 мМ), по 2 мкл каждого праймера (15 пкМ/мкл) и 2 мкл Taq ДНК-полимеразы (из расчета на каждую пробу). После начальной денатурации (3 мин при 94°С) проводили ПЦР в течении 35 циклов (денатурация 1 мин при 94°С, отжиг 40 сек при 60°С, синтез 1 мин при 72°С) в амплификаторе Minicicler фирмы Mjresearch (USA). Продукты реакционной смеси разделяли электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле в ТЕ-буфере и окрашивали бромистым этидием. Трансформация кукурузы (Кукур.) подтверждается (Фиг.1), трансформация пшеницы (Пшен.) и ячменя (ячм.) (Фиг.2).

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что в качестве эксплантов используют незрелые зародыши кукурузы, а обработка ведется посредством вакуумной инфильтрации при -0,6 атм в течение 15 минут.

Пример 5. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что используют обработку посредством вакуумной инфильтрации в течение 30 минут.

Пример 6. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что используют обработку посредством вакуумной инфильтрации в течение 60 минут.

Пример 7. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что в качестве эксплантов используют зрелые зародыши кукурузы, а обработка ведется вакуумной инфильтрацией в течение 15 минут.

Пример 8. Проводят аналогично примеру 7, с той лишь разницей, что используют обработку посредством вакуумной инфильтрации в течение 30 минут.

Пример 9. Проводят аналогично примеру 7, с той лишь разницей, что используют обработку посредством вакуумной инфильтрации в течение 60 минут.

Пример 10. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что в качестве эксплантов используют зрелые зародыши ячменя, а обработка ведется посредством вакуумной инфильтрации в течение 15 минут.

Пример 11. Проводят аналогично примеру 10, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 12. Проводят аналогично примеру 10, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 13. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что в качестве эксилантов используют зрелые зародыши пшеницы, а обработка ведется посредством вакуумной инфильтрации в течение 15 минут.

Пример 14. Проводят аналогично примеру 13, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 15. Проводят аналогично примеру 13, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 16. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 0,8 атм.

Пример 17. Проводят аналогично примеру 16, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 18. Проводят аналогично примеру 16, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 19. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 0,8 атм.

Пример 20. Проводят аналогично примеру 19, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 21. Проводят аналогично примеру 19, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 22. Проводят аналогично примеру 7, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 0,8 атм.

Пример 23. Проводят аналогично примеру 22, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 24. Проводят аналогично примеру 22, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 25. Проводят аналогично примеру 10, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 0,8 атм.

Пример 26. Проводят аналогично примеру 25, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 27. Проводят аналогично примеру 25, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 28. Проводят аналогично примеру 13, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 0,8 атм.

Пример 29. Проводят аналогично примеру 28, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 30. Проводят аналогично примеру 28, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 31. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 1,0 атм.

Пример 32. Проводят аналогично примеру 31, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 33. Проводят аналогично примеру 31, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 34. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 1,0 атм.

Пример 35. Проводят аналогично примеру 34, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 36. Проводят аналогично примеру 34, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 37. Проводят аналогично примеру 7, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 1,0 атм.

Пример 38. Проводят аналогично примеру 37, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 39. Проводят аналогично примеру 37, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 40. Проводят аналогично примеру 10, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 1,0 атм.

Пример 41. Проводят аналогично примеру 40, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 42. Проводят аналогично примеру 40, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Пример 43. Проводят аналогично примеру 13, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией при - 1,0 атм.

Пример 44. Проводят аналогично примеру 43, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 30 минут.

Пример 45. Проводят аналогично примеру 43, с той лишь разницей, что используют обработку вакуумной инфильтрацией в течение 60 минут.

Таблица№№ ПримеровЭксплантВремя обработки -0,6 атм вакуумом (минут)Частота Км-устойчивых растений %№№ ПримеровВремя обработки -0,8 атм вакуумом (минут)Частота Км-устойчивых растений, %№№ ПримеровВремя обработки -1,0 атм вакуумом (минут)Частота Км-устойчивых растений, %1Эмбриогенный каллус кукурузы1515,2161519,631157,923020,3173025,7323010,33609,8186015,533606,84Незрелые зародыши кукурузы1511,7191514,434159,653019,3203021,3353016,866014,8216018,1366011,77Зрелые зародыши кукурузы158,8221517,2371515,583016,4233020,9383018,696010,1246019,7396012,910Зрелые зародыши ячменя157,4251515,3401515,8113020,8263025,3413019,6126013,6276019,3426018,313Зрелые зародыши пшеницы158,6281513,8431511,5143014,3293020,3443012,7156012,9306015,2456010,41) "Частота канамицинустойчивых растений" есть отношение количества Км-устойчивых растений к количеству эксплантов (%).

В результате настоящего способа обеспечено увеличение выхода канамициноустойчивых растений от 6,8% до 25,7% для эмбриогенного каллуса кукурузы, от 9,6% до 21,3% для незрелых зародышей кукурузы, от 8,8% до 20,9% для зрелых зародышей кукурузы, от 7,4% до 25,3% для зрелых зародышей ячменя, от 8,6% до 20,3% для зрелых зародышей пшеницы при стабильной воспроизводимости результатов, при этом в качестве эксплантов использовали как эмбриогенный каллус, так и незрелые 10-12 дневные зародыши, из которых идет морфогенез с последующей культивацией и регенерацией, а также зрелые зародыши, начиная с 15-20 дня после опыления - исключающие стадию морфогенеза, что значительно расширит область применение данного способа, а улучшение его технологичности за счет неприменения энергоемкого специального оборудования и эффективного использования растительного материала позволит применять его и для получения других зерновых культур.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве. Эмбриогенный каллус, незрелые или зрелые зародыши обрабатывают вакуумной инфильтрацией при -1,0÷-0,6 атм в течение 15-60 минут в суспензии бактерий Agrobacterium tumefaciens. Затем полученные экспланты культивируют на газоне упомянутых бактерий, которые предварительно активизированы экссудатом табака. После культивации эксплантов в суспензию бактерий добавляют цефотаксим в концентрации 100-300 мг/л. Последующее добавление канамицина позволяет в дальнейшем отобрать трансформированные растения. 2 ил., 1 табл.

Способ получения трансформированных растений зерновых культур, заключающийся в обработке эмбриогенного каллуса, незрелых или зрелых зародышей вакуумной инфильтрацией при -1,0÷-0,6 атм в течение 15-60 мин в суспензии Agrobacterium tumefaciens и последующей культивации эксплантов на газоне упомянутых бактерий, предварительно активизированных экссудатом табака, добавляя сначала цефотаксим в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамицинустойчивых растений.