СПОСОБ ОБРАБОТКИ ЭМБРИОГЕННОГО КАЛЛУСА КУКУРУЗЫ IN VITRO Российский патент 2003 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области физиологии растений.

В настоящее время, например, у яблони антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 200 мг/л улучшал регенерацию и развитие побегов из апикальных почек, в концентрации 500 мг/л вызывал уродства у образующихся побегов (Yepes L.M., Aldwinckle H.S. Factors that affectleaf regeneration efficiency in apple, and effect of antibiotics in morphogenesis // Plant Cell Tissue Organ Culture - 1994 - v.37 - N3 - p.257-269). У хлопчатника Сх в зависимости от сорта или стимулировал, или ингибировал развитие побегов из изолированных зародышевых осей (Agrawal D.C., Banerjee A.K., Kedari P.H., Jacob S. , Hazra S., Krishnamurthy K.V. Effect of cefotaxime on the growth of excised embryo-axes of 6 cultivars of cotton (Gossypium hirsutum L.) // J. Plant Physiology - 1998 - v.152 - Iss.4-5 - p.580-582). У табака Сх слабо ингибировал образование побегов из семядольных эксплантов и укоренение регенерантов, полученных из листовых дисков (Nauerby В., Billing К., Wyndaele R. Influence of the antibiotic timentin on plant regeneration compared to carbenicillin and cefotaxime in concentration suitable for elimination of Agrobacterium tumefaciens // Plant Science - 1997 - v. 123 - N 1-2 - р. 169-177).

Если реакция эксплантов двудольных растений на цефалоспориновые антибиотики была неоднозначной, то у твердой и мягкой пшениц отмечена стимуляция регенерации растений (Borrelli G.M., Difonzo N., Lupotto E. Effect of cefotaxime on callus culture and plant regeneration in durum wheat // J. Plant Physiology - 1992 - v.140 - Iss.3 - p.372-374), у ячменя и сорго - происходило усиление роста каллуса, эмбриогенеза и регенерации растений (Rao A.M. , Sree К. Р., Kishor P.B.K. Enhanced plant regeneration in grain and sweet sorghum by asparagine, proline and cefotaxime // Plant Cell Rep. - 1995 - v. l5 -N 1-2 - p.72-75).

Однако для кукурузы этот эффект в научно-технической и патентной литературе неизвестен, хотя проблема регенерации эмбриогенного каллуса кукурузы in vitro является очень важной.

Задачей настоящего изобретения является создание такого способа обработки эмбриогенного каллуса кукурузы in vitro, который бы обеспечивал увеличение частоты регенерации из эмбриогенного каллуса кукурузы, способствовал ускоренной дифференцировке каллусных структур, регулируемости и контролируемости процесса регенерации, а также стабильности в воспроизводимости результатов и улучшение его технологичности.

Эта задача решается новым способом обработки эмбриогенного каллуса кукурузы in vitro, заключающимся в культивировании эмбриогенного каллуса кукурузы на питательной среде, причем культивирование эмбриогенного каллуса кукурузы проводят на питательной среде, содержащей антибиотик цефотаксим, который добавляют в момент, необходимый для получения регенерантов, в концентрации 100-300 мг/л.

Заявляемые пределы концентрации цефотаксима определяются следующим образом. Использование концентрации ниже 100 мг/л не стимулирует процесс регенерации, а при использовании концентрации выше 300 мг/л подавляется регенерационная способность эмбриогеного каллуса.

Сущность изобретения, по мнению авторов, заключается в том, что совершенно неожиданным образом выявилось, что добавление цефотаксима стимулирует процесс регенерации и способствует ускоренной дифференцировке каллусных структур.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Результаты, представленные в примерах 1-12 являютя воспроизводимыми и математически усредненными и представлены в таблице.

Пример 1 (контроль). Эмбриогенный каллус кукурузы линии 91 (Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б., Жданова Н.Е., Пустовойтова Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, поллученных из устойчивых к осмотическому действию полиэтиленгликоля клеточных линий. // Физиология растений - 1994 - т. 41 - 6 - с. 853-858) культивируют на твердой питательной среде. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 2. Эмбриогенный каллус кукурузы линии 91 культивируют на твердой питательной среде. В момент, когда исследователям необходимо получение регенерантов, в питательную среду добавляют антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 100 мг/л. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 3. Эмбриогенный каллус кукурузы линии 91 культивируют на твердой питательной среде. В момент, когда исследователям необходимо получение регенерантов в питательную среду, добавляют антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 200 мг/л. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 4. Эмбриогенный каллус кукурузы линии 91 культивируют на твердой питательной среде. В момент, когда исследователям необходимо получение регенерантов, в питательную среду добавляют антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 300 мг/л. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 5 (контроль). Эмбриогенный каллус кукурузы линии А188 (Green C.E. Somatic embryogenesis and plant regeneration from friable callus of Zea mats. // In plant tissue culture, maruzen со., Tokyo, Japan - 1982 - Ed. Fujiwara A. - p. 107-108) культивируют на твердой питательной среде. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 6. Эмбриогенный каллус кукурузы линии А188 культивируют на твердой питательной среде. В момент, когда исследователям необходимо получение регенерантов, в питательную среду добавляют антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 100 мг/л. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 7. Эмбриогенный каллус кукурузы линии А188 культивируют на твердой питательной среде. В момент, когда исследователям необходимо получение регенерантов, в питательную среду добавляют антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 200 мг/л. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 8. Эмбриогенный каллус кукурузы линии А188 культивируют на твердой питательной среде. В момент, когда исследователям необходимо получение регенерантов, в питательную среду добавляют антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 300 мг/л. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 9 (контроль). Эмбриогенный каллус кукурузы гибрида между линиями А188х91 культивируют на твердой питательной среде. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 10. Эмбриогенный каллус кукурузы гибрида А188х91 культивируют на твердой питательной среде. В момент когда исследователям необходимо получение регенерантов в питательную среду добавляют антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 100 мг/л Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 11. Эмбриогенный каллус кукурузы гибрида А188х91 культивируют на твердой питательной среде. В момент когда исследователям необходимо получение регенерантов в питательную среду добавляют антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 200 мг/л Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Пример 12. Эмбриогенный каллус кукурузы гибрида А188х91 культивируют на твердой питательной среде. В момент, когда исследователям необходимо получение регенерантов, в питательную среду добавляют антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 300 мг/л. Полученные регенеранты используют для дальнейших исследований.

Как следует из результатов таблицы, способ обработки эмбриогенного каллусса кукурузы in vitro обеспечивает увеличение регенерации из эмбриогенного каллуса кукурузы в 5-10 раз, способствует ускоренной дифференцировке каллусных структур в 3-4 раза, за счет повышения частоты регенерации, обеспечивает регулируемость и контролируемость процесса регенерации, а также достигает стабильности в воспроизводимости результатов при улучшении его технологичности.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области физиологии растений. Обработка эмбриогенного каллуса кукурузы in vitro заключается в культивировании эмбриогенного каллуса кукурузы на питательной среде, содержащей антибиотик цефотаксим, который добавляют в момент, необходимый для получения регенерантов, в концентрации 100-300 мг/л. Изобретение обеспечивает увеличение регенерации из эмбриогенного каллуса кукурузы в 5-10 раз, способствует ускоренной дифференцировке каллусных структур в 3-4 раза, за счет повышения частоты регенерации, обеспечивает регулируемость и контролируемость процесса регенерации, а также достигает стабильности в воспроизводимости результатов при улучшении его технологичности. 1 табл.

Способ обработки эмбриогенного каллуса кукурузы in vitro, заключающийся в культивировании эмбриогенного каллуса кукурузы на питательной среде, отличающийся тем, что культивирование эмбриогенного каллуса кукурузы проводят на питательной среде, содержащей антибиотик цефотаксим, который добавляют в момент, необходимый для получения регенерантов, в концентрации 100-300 мг/л.