НАБОР ДЛЯ РАННЕЙ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/569 G01N33/535 G01N33/543 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для широкомасштабной ранней иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита животных.

Известен набор для диагностики инфекционного ринотрахеита животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), содержащий панели для постановки ИФА, антиген вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, анти-ИРТ сыворотку, контрольную сыворотку, антивидовой иммунопероксидазный конъюгат, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, Твин-80, лимонную кислоту, ортофенилендиамин и перекись водорода [1] . Однако указанный набор предназначен для ретроспективной диагностики путем выявления специфических антител и не позволяет проводить раннюю диагностику путем выявления антигенов вируса инфекционного ринотрахеита с первых дней проявления клинических признаков заболевания, а также требует большего времени для постановки реакции.

Целью заявляемого изобретения является ранняя иммуноферментная диагностика инфекционного ринотрахеита животных путем выявления специфических антигенов вируса инфекционного ринотрахеита в носовых и влагалищных экссудатах, сперме и другом клиническом материале. Указанная цель достигается тем, что в состав набора входят: 96-луночные микропланшеты из полистирола, сенсибилизированные аффинно-очищенными моноклональными антителами к различным гликопротеинам вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, в количестве 25-35 нг на лунку, контрольный положительный антиген вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2 [2], с титром инфекционности 1,5-2,5 lg ТЦД_50/см ³, контрольный отрицательный антиген, конъюгат моноклональных антител к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита с пероксидазой (анти-ИРТ конъюгат), 20-кратный концентрат калийфосфатного буфера, неионный детергент (Твин-20, -80 или Тритон Х-305), 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода и стоп-реагент.

В состав набора входят следующие биологические и химические компоненты:
1. 96-луночные микропланшеты из полистирола, сенсибилизированные аффинно-очищенными моноклональными антителами к различным гликопротеинам вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, в количестве 25-35 нг на лунку 2 шт.

2. Контрольный положительный антиген вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, с титром инфекционности 2,0 ± 0,25 lg ТЦД_50/см ³, объем 0,5 см³, 1 ампула (фл.), титр в ИФА не ниже 1:3200.

3. Контрольный отрицательный антиген, объем 0,5 см³, 1 ампула (фл.).

4. Конъюгат моноклональных антител к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита с пероксидазой (анти-ИРТ конъюгат), 1 амп. (фл.), объем 1 см³, рабочее разведение 1:20.

5. 20-кратный концентрат инкубационного буфера (0,2 М калийфосфатный буфер, содержащий 3 М натрия хлористого, рН 7,3), 1 фл., объем 50 см³.

6. Твин-20, -40, -80 или тритон Х-305, 1 фл., 1 см³.

7. 10-кратный концентрат субстратного буфера (1,5 М фосфатно-цитратный буферный раствор, рН 5,0), 1 фл., объем 5 см³.

8. Ортофенилендиамин (ОФД), 1 фл., 20 мг.

9. Гидроперит (перекись водорода), 1 табл., 0,5 г.

10. Стоп-реагент - 1 М раствор серной кислоты, 1 фл., объем 10 см³.

Приготовление компонентов набора.

1. Приготовление рабочих буферов
1.1. Инкубационный фосфатно-солевой твиновый буферный раствор предназначен для разведения исследуемых образцов и анти-ИРТ конъюгата, а также для промывки микропанелей. Содержимое флакона 5 с 20-кратным калийфосфатным буфером доводят дистиллированной водой до 1000 см³ и растворяют в этом объеме 1 см³ Твина-20, -40, -80 или тритона Х-305 (флакон 6). Инкубационный буфер представляет собой прозрачный раствор с рН 7,2-7,4.

1.2. Субстратный цитратно-фосфатный буферный раствор рН 5,0-5,2 готовят доведением содержимого флакона 7 с 10-кратным цитратно-фосфатным буфером до 50 см³ дистиллированной водой.

Раствор субстрата готовят не ранее чем за 10 мин до внесения в лунки панелей. Для этого 20 мг ортофенилендиамина (флакон 8) растворяют в 2 см³ спирта-ректификата, добавляют 48 см³ субстратного буфера и вносят 0,8 см³ раствора перекиси водорода, полученного растворением таблетки гидроперита (реактив 9) в 10 см³ дистиллированной воды. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет.

2. Получение микропанелей, сенсибилизированных моноклональными антителами к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Самцам инбредной линии мышей Balb/c вводят интраперитонеально по 1 мл пристан (Sigma). Через 7 дней после праймирования вводят внутрибрюшинно по 1 мл суспензии гибридных клеток (полученных в лаборатории иммунологии ВНТИТИБП) [3] , продуцирующих моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, в концентрации 5 млн клеток/см³. После образования асцитных опухолей асцитные жидкости осветляют центрифугированием при 2500 об/мин в течение 25-30 минут и проводят очистку моноклональных антител аффинной хроматографией на протеин-А Сефарозе 4В. Оптимальную концентрацию моноклональных антител для сенсибилизации микропанелей исследовали шахматным титрованием его с контрольным антигеном вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, с титром инфекционности от 1,5 до 2,5 1g ТЦД_50/см ³ в ИФА (табл. 1).

Пример 1. Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита в концентрации 250 нг/см³ 0,01 М калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2 - 7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Затем в лунки микропланшет добавляют по 0,1 см³ положительного контрольного антигена вируса инфекционного ринотрахеита с титром инфекционности от 1,0 до 3,0 lg ТЦД_50/см ³ в инкубационном буфере, приготовленном согласно п. 1.1. После часовой инкубации при +37^oС и пятикратной промывки инкубационным буфером в каждую лунку добавляют по 0,1 см³ рабочего разведения анти-ИРТ иммунопероксидазного конъюгата и инкубируют в течение часа при +37^oС. Затем микропланшеты пятикратно отмывают инкубационным буфером и проявляют реакцию субстратным буфером, приготовленным как описано в п. 1.2. Реакцию учитывают через 30 минут спектрофотометрически при длине волны 492 нм (ОП₄₉₂). Результаты выражают в оптических единицах (о.е.).

Пример 2. Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита в концентрации 300 нг/см³ 0,01 М калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2 - 7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят как описано в примере 1.

Пример 3. Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита в концентрации 350 нг/см³ 0,01 М калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2 - 7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят как описано в примере 1.

Пример 4. Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита в концентрации 200 нг/см³ 0,01 М калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2 - 7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят как описано в примере 1.

Пример 5. Моноклональные антитела к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита в концентрации 400 нг/см³ 0,01 М калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2 - 7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшет для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37^oС пятикратно промывают тем же буфером и подсушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят как описано в примере 1.

По результатам шахматного титрования моноклональных антител и контрольного антигена в реакции ИФА установлена оптимальная рабочая концентрация моноклональных антител к вирусу инфекционного ринотрахеита - 300 нг/см³ адсорбционного буфера при титре инфекционной активности положительного антигена вируса инфекционного ринотрахеита 2,0 ± 0,25 lg ТЦД_50/см ³ (табл. 1).

3. Приготовление контрольного положительного антигена вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Контрольный положительный вирусный антиген готовят путем заражения монослойной матрасной, роллерной или выращенной на микроносителях культуры клеток ПТ-80, вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, в дозе 0,01-0,005 ТЦД/кл. Сбор вируссодержащей культуральной жидкости проводят в момент максимального проявления цитопатического действия вируса. Активность накопленного вируса проверяют путем титрования его на культуре клеток ПТ-80. Для получения контрольного антигена используют вирус с инфекционной активностью 10⁵-10^6,5 ТЦД_50/см ³. Для освобождения от клеточного дебриса культуральную вируссодержащую жидкость центрифугируют при 3500 об/мин в течение 25-30 минут, надосадок разводят 0,01 М калийфосфатным буфером, содержащим 0,15 М натрия хлористого, 0,1% Тритона Х-100 и 0,02% азида натрия до конечной инфекционной активности 2,0 ± 0,25 lg ТЦД_50/см ³, разливают по 0,5 см³ в ампулы или флаконы и укомплектовывают ими набор.

5. Получение конъюгата моноклональных антител к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Моноклональные анти-ИРТ антитела, меченные ферментом пероксидазой, готовят в соответствии с [4] и укомплектовывают ими набор.

6. Иллюстрация применения набора.

6.1. Подготовка биологических компонентов набора для ранней иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита животных.

Содержимое каждой ампулы или флакона 4 с анти-ИРТ конъюгатом растворяют в 20 см³ инкубационного буфера, получая рабочую концентрацию конъюгата. По 0,05 см³ исследуемых образцов разводят инкубационным буфером в 5 раз. Растворенный анти-ИРТ конъюгат можно хранить при температуре 5 ± 1^oС в течение 3-4 дней.

6.2. Постановка иммуноферментной реакции (ИФА).

6.2.1. Титрование антигенов вируса инфекционного ринотрахеита: антигены титруют по короткому ряду панели. Во все лунки панели, исключая лунку ряда панели 1А, используемую для контроля субстратной смеси и вывода прибора на "ноль", вносят по 0,1 см³ инкубационного буфера. В лунку ряда 1 (начиная с 1В) вносят по 0,1 см³ контрольного положительного антигена 2, в лунку ряда 1 (начиная с 1А) вносят по 0,1 см³ контрольного отрицательного антигена 3, в лунки остальных рядов, начиная с 3, вносят по 0,1 см³ исследуемых проб, предварительно разведенных 1:5 в инкубационном буфере в отдельных пробирках или планшетах. Содержимое всех лунок титруют по короткому ряду для каждого образца, используя при этом сменные наконечники к микропипеткам, и получают разведение образцов от 1:5 до 1:640. Из последних лунок каждого ряда по 0,1 см³ содержимого удаляют. Микропанели закрывают крышкой, инкубируют при 37 ± 0,5^oС в течение часа и затем пятикратно промывают инкубационным буфером.

В лунки отмытых микропанелей вносят по 0,1 см³ рабочего раствора анти-ИРТ конъюгата, подготовленного согласно п.6.1, инкубируют в термостате при 37 ± 0,5^oС 1 час и промывают пять раз инкубационным буфером.

Для проявления реакции во все лунки панели вносят по 0,1 см³ раствора субстрата и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30 мин. Через 30 мин реакцию останавливают, добавляя в каждую лунку 0,05 см³ стоп-реагента 10.

Результат учитывают спектрофотометрически не позднее 30 мин после проявления реакции и выражают в единицах оптической плотности (ОП₄₉₂). За титр в ИФА принимают разведение образца, дающее значение ОП₄₉₂, в 2 раза превышающее значение ОП₄₉₂ контрольного отрицательного антигена.

6.2.2. При эпизоотологическом обследовании поголовья с целью выявления больных животных образцы не титруют, а используют в одном разведении 1:5, но в двух повторностях, используя для каждого образца по 2 лунки плашки. Постановку реакции и подготовку образцов осуществляют как описано в п.6.2.1. Панели закрывают крышкой и выдерживают при температуре 37 ± 0,5^oС в термостате в течение 1 часа.

Отмывку микропанелей, внесение конъюгата и проявление реакции проводят как описано в п.6.2.1.

Результат учитывают не позднее 30 мин после проявления реакции визуально или спектрофотометрически.

Визуальный учет: при наличии в образцах специфических антигенов вируса лунки с исследуемыми пробами имеют оранжево-коричневое окрашивание в разведении 1: 5, сравнимое с цветом раствора в положительном контроле. Отрицательными считают пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят при длине волны 492 нм. Результаты выражают в единицах оптической плотности (ОП₄₉₂). Положительными считают пробы, ОП₄₉₂ которых в разведении 1:5 в 2 и более раза превосходят оптическую плотность отрицательного контроля. Сомнительными считают пробы, ОП₄₉₂ которых составляет 0,150-0,199 о.е. Уровень оптической плотности ниже 0,150 о.е. свидетельствует об отрицательной реакции.

Предлагаемый набор был испытан при сравнительном титровании исследуемых образцов носовых выделений телят с клиническими признаками инфекционного ринотрахеита методом ИФА и реакции торможения нейтрализации (РТН). Результаты представлены в табл. 2.

Установлено, что с 1 по 30 день после проявления первых клинических признаков положительные результаты были получены в обоих методах. Все отрицательные образцы в ИФА были отрицательными и РТН. Однако на 40 день инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота диагностировался в 26% случаев только при помощи заявляемого набора ИФА, а начиная с 50 дня в 100% случаев.

Источники информации
1. Технические условия 19.10.97-89 "Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 01.08.89 (прототип).

2. Паспорт Всероссийского контрольного института ветеринарных препаратов на штамм ТК-А (ВИЭВ) В2.

3. Кузнецова С. В. , Кузнецов Д.П., Самуйленко А.Я., Белоусов В.И. // Получение и очистка моноклональных антител к вирусу ИРТ КРС // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции "Вирусные болезни с/х животных", Владимир, 1995, с. 75.

4. Технические условия 46-78-85 "Временная инструкция по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой", утвержденная ГУВ МСХ СССР 19.12.85.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Набор содержит 96-луночные микропланшеты, сенсибилизированные афинно-очищенными моноклональными антителами к различным гликопротеинам вируса ИРТ, контрольный положительный антиген вируса ИРТ, контрольный отрицательный антиген, конъюгат моноклональных антител к антигенам вируса ИРТ с пероксидазой, 20-кратный концентрат калийфосфатного буфера, неионный детергент, 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода и стоп-реагент. Набор позволяет проводить раннюю диагностику ИРТ животных, начиная с первого дня клинических проявлений. 2 табл.

Набор для ранней иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита животных, отличающийся тем, что он содержит 96-луночные микропланшеты из полистирола, сенсибилизированные аффино-очищенными моноклональными антителами к различным гликопротеинам вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2 в количестве 25-35 нг на лунку, контрольный положительный антиген вируса инфекционного ринотрахеита, штамм ТК-А (ВИЭВ) В2 с титром инфекционности 1,5-2,5 Lg ТЦД_50/см ³, контрольный отрицательный антиген, коньюгат моноклональных антител к антигенам вируса инфекционного ринотрахеита с пероксидазой (анти-ИРТ коньюгат), 20-кратный концентрат калийфосфатного буфера, неионный детергент (Твин -20, -80 или Тритон Х-305), 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода и стоп-реагент.