Способ прогнозирования тяжелого течения увеальной меланомы Российский патент 2019 года по МПК A61B10/00 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно, к офтальмологии и предназначено для прогнозирования тяжелого течения увеальной меланомы.

Увеальная меланома (УМ) - злокачественная опухоль нейроэктодермального происхождения, часто встречающаяся среди людей трудоспособного возраста и склонная к раннему метастазированию [Офтальмоонкология. Под ред. Бровкиной А.Ф. М: Издательство Медицина; 2002., Офтальмология. Клинические рекомендации. Под ред. Нероева В.В. ГЭОТАР-Медиа, 2019]. В РФ частота УМ колеблется от 6,2 до 8 новых случаев на 1 млн. населения в год [Офтальмоонкология. Под ред. Бровкиной А.Ф. М.: Издательство Медицина; 2002.].

Среди разнообразных направлений исследований в фундаментальной онкологии в последние два десятилетия большое внимание уделяют изучению микроокружения (МО) опухолей [Бережная Н.М. Роль системы иммунитета в микроокружении опухоли. I. Клетки и цитокины - участники воспаления. Онкология.2009; 11 (1): 6-17; Борисов К.Е., Сакаева Д.Д. Опухолевое микроокружение как мишень терапии злокачественных глиом. Диагностика и лечение опухолей. 2015; (4): 14-23]. По мнению отечественных и зарубежных ученых МО принимает активное участие в жизнедеятельности опухоли, обеспечивая рост, пролиферацию и миграцию злокачественных клеток [Mantovani Д., Romero P., Palucka А. К., Marincola F.M. Tumour immunity: effector response to tumour and role of the microenvironment. Lancet. 2008; 371 (9614): 771-83.]. Большинство разработок в области таргетирования опухолевого МО находятся на ранних стадиях, однако новые тенденции изменения парадигмы противоопухолевого лечения с обязательным включением в него препаратов, воздействующих не только на собственно опухоль, но и на клетки МО, начинают приобретать все большее значение [Fidler I.J., Kim S.J., Langiey R.R. The role of the organ microenvironment in the biology and therapy of cancer metastasis. J. Cell Biochem. 2007; 101 (4): 927-36.].

Тучные клетки (TK) - популяция, впервые описанная P. Erlich в 1877 г., являются одним из компонентов опухолевого МО [Ehrlich P. Beitrag zur Kenntnis der Anilinfar-bungen und ihrer Verwendung in der mikro-skopischen Technik. Arch. mikr. Anat. 1877; 13: 263]. TK происходят из костномозговых предшественников - стволовых клеток CD34, которые мигрируют из крови в ткани под влиянием фактора роста стволовых клеток при участии адгезивных молекул и прикрепляются к сосудистой стенке. Это обеспечивает им контакт с нервными окончаниями и эндотелием капилляров [Бережная НМ, Сепиашвили РИ. Тучные клетки. Иммунология и аллергология. 2003; 4 (3): 29-38]. В нормальных тканях ТК дифференцируются в коже, серозных полостях, являются обязательным компонентом соединительной ткани, располагаясь преимущественно вокруг мелких артериальных и лимфатических сосудов. Клетки могут быть округлыми, овальными, иногда веретеновидными при расположении между коллагеновыми волокнами и редко отростчатой формы. Ядро - округлое или овальное, часто гиперхромное. Важнейшей особенностью тучных клеток является множественность продуктов их секреции и многонаправленность действия, что создает в целом их полифункциональность. В цитоплазме определяются эозинофильно окрашивающиеся гранулы, которые, по данным исследований некоторых ученых, содержат гепарин, гистамин, серотонин, протеолитические ферменты, простагландины [Быков В.Л. Секреторные механизмы и секреторные продукты тучных клеток. Морфология. 1999; 2:64-72].

По мнению одних авторов, ТК могут стимулировать рост опухолей, усиливать их ангиогенез за счет своих медиаторов (гепарина, интерлейкина-8, сосудистого эндотелиального фактора роста), которые выделяются в результате клеточной дегрануляции [Ribatti D., Crivellato Е., Roccaro A.M., Ria R., Vacca A. Mast cell contribution to angiogenesis related to tumour progression. Clin Exp Allergy. 2004; 34 (11): 1660-4. https://doi.org/10.1111365-2222.2004.02104.x]. При этом происходит расщепление коллагена базальной мембраны за счет протеаз и металлопротеиназ, что облегчает перемещение эндотелиальных клеток при образовании новых сосудов. Кроме того, усилению ангиогенеза может способствовать аденозин, рецепторы к которому экспрессируют ТК [Feoktistov I., Goldstein А.Е., Ryzhov S., Biaggioni I. Mast cell-mediated stimulation of angiogenesis: cooperative interaction between A2B and A3 adenosine receptors. Circ. Res. 2003; 92 (5): 485-92. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000061572.10929.2D].

Гепарин TK обладает антикоагулянтными свойствами, предотвращает образование тромбов в сосудах, активирует металлопротеиназы и является активатором плазминогена, что способствует процессу метастазирования [Ch'ng S., Wallis R., Yuan L., Davis P., Tan S.T. Mast cells and cutaneous malignancies. Mod Pathol. 2006; 19 (1): 149-59. https://doi.org/149-59. 10.1038/modpathol.3800474]. Кроме того, взаимодействие секрета ТК с клетками опухоли, вызывает увеличение продукции IL-17, обладающего иммуносупрессивным действием [Bi Y., Liu G., Yang R. Th17 cell induction and immune regulatory effects. J. Cell Physiol. 2007; 211 (2): 273-8. https://doi.Org/10.1002/jcp.20973].

Инфильтрация TK характерна для многих опухолей: меланомы, нейросаркомы, карциномы легкого, яичника и многих других [Ribatti D., Ennas M.G., Vacca A., Ferreli Р., Nico В., Orra S., Sirigu P. Tumor vascularity and tryptase-positive mast cells correlate with a poor prognosis in melanoma. Eur. J. Clin. Invest. 2003; 33 (5): 420-5. https://doi.org/10.1046/j.1365-2362.2003.01152.x]. В настоящее время количество работ, посвященных изучению ТК в микроокружении УМ, единичны [Bronkhorst I.H.G., Jager M.J. Inflammation in uveal melanoma. Eye (Lond). 2013; 27(2):217-23], а для прогноза течения заболевания их наличие и количество не оценивали.

Известны способы прогнозирования течения увеальной меланомы по уровню показателей сыворотки крови и слезной жидкости: интерферона-гамма (RU 2157998, 20.10.2000); фактора некроза опухоли альфа (RU 2193200, 20.11.2002); по иммуногистохимическому анализу клеток удаленной опухоли с определением процента иммунопозитивных клеток, экспрессирующих рецептор Flt в ядре (RU 2193200, 20.11.2002). Однако эти способы являются довольно трудоемкими и дорогостоящими.

Известен способ прогнозирования течения увеальной меланомы на основе данных ультразвукового исследования в В-режиме с биометрическим определением элевации опухоли, в режиме цветового картирования или энергетической допплерографии - степени васкуляризации меланомы, в режиме спектральной допплерографии - средней величины периферического сосудистого сопротивления в новообразованном русле с вычислением суммарной кодовой величины по определенной формуле (RU 2280410, 27.07.2006). Данный способ принят за ближайший аналог.

Задачей настоящего изобретения является разработка прогнозирования тяжелого течения УМ на основе патоморфологических исследований.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности определения тяжести течения увеальной меланомы за счет патоморфологического исследования для выбора дальнейшей тактики лечения.

Технический результат достигается за счет проведения патоморфологического исследования и выявления наличия тучных клеток в микроокружении УМ в сочетании с распространением опухолевых клеток в просветах эмиссариев склеры.

Нами были изучены 43 энуклеированных глаза с УМ (260 гистологических препаратов). Возраст пациентов составил от 35 до 65 (в среднем 54±2,7) лет. Определен патоморфологический тип УМ: эпителиоидноклеточная (n=9; 20,9%), веретеноклеточная тип АВ (n=15; 34,9%), смешанноклеточная (n=19; 44,2%). Проминенция опухоли составила от 1,5 до 7,1 мм (в среднем 4,7±1,3), диаметр основания от 1,5 до 16,5 мм (в среднем 13,5±3,3). При этом опухоли T1N0M0 (6 глаз) локализовались юкстапапиллярно с вовлечением диска зрительного нерва, что потребовало энуклеации. По локализации опухолевого узла значительно преобладали опухоли хориоидеи (n=40; 93%), опухоли иридоцилиохориоидальной зоны наблюдались только у трех пациентов (n=3; 7%). По степени пигментации выделяли слабо пигментированные (n=16; 37,2%), умеренно пигментированные (n=7; 16,3%), густо пигментированные (n=20; 46,5%) опухоли. Все 43 пациента, глаза которых исследовали после энуклеации, до операции лечения не получали.

ТК в микроокружении УМ морфологически представляли собой полиморфные клетки округлой и овальной формы, с округлым гиперхромным ядром, с наличием розовых цитоплазматических гранул. При окрашивании специфическим красителем толуидиновым синим ТК проявлялись ярко-синим цветом, ткань меланомы - зеленым. Они локализовались не только непосредственно вокруг опухолевого узла, но и на некотором отдалении от него в строме хориоидеи.

По результатам исследования в зависимости от числа ТК в микроокружении УМ мы выделили две степени их накопления: 1-я степень -1-5 клеток, 2-я степень - 6 и более клеток. И при 2-й степени накопления ТК и наличия опухолевых клеток в просвете хотя бы одного эмиссария отмечали склонность к метастазированию, то есть тяжелое течение УМ.

Патоморфологическое исследование проводили следующим образом. Энуклеированные глаза фиксировали в 10% забуференном формалине. После вскрытия глазного яблока центральную колодку и кусочек опухоли из боковой колодки пускали в проводку в автоматический тканевой процессор для проведения обезвоживания и затем заключали в парафин с использованием современной станции для заливки в парафин с микропроцессорным управлением (фирма Leica, Germany). После микротомии парафиновые срезы (5-6 мкм) окрашивали гематоксилин-эозином и пикрофуксином по методу Ван-Гизона. Кроме того, проводили специальное окрашивание срезов специфическим красителем для выявления ТК - толуидиновым синим Гистологические исследования проводили с помощью микроскопической системы фирма Leica, Germany с увеличением от 50 до 630 раз.

Способ осуществляют следующим образом

Проводят патоморфологическое исследование микроокружения опухоли энуклеированного глаза. При выявлении в нем 6 и более тучных клеток и наличии опухолевых клеток в просвете хотя бы одного эмиссария прогнозируют тяжелое течение увеальной меланомы.

Пример 1. Пациент В., 57 лет обратился с жалобами на появление искажения формы предметов перед правым глазом.

Проведенные офтальмологические исследования:

Визометрия: Visus OD - 0,5 н.к.,

VisusOS - 1,0.

Тонометрия: ВГД OD -16 мм. рт.ст., OS - 16 мм. рт.ст.

Биомикроскопия: OD - спокоен, среды прозрачны,

Прямая офтальмоскопия:

OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. Юкстапапиллярно с распространением на ДЗН зоне по меридианам с 11 до 13 часов определяется проминирующее образование аспидного цвета, с нечеткими, неровными границами, гладкой поверхностью. Вторичная отслойка сетчатки.

OS - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено. Эхография:

OD - «+» - ткань с проминенцией 2,5 мм, диаметром основания 10 мм,

OS - «+» - ткань не определяется.

В связи с папиллярной локализацией опухоли независимо от ее размеров по данным УЗИ, проведена энуклеация правого глаза.

Проведены патоморфологические исследования. Выявлен смешанноклеточный тип УМ, в микроокружении опухоли диагностировано 6 и более ТК с выявлением опухолевых клеток в просвете эмиссария, что свидетельствовало о дальнейшем тяжелом течении УМ. Наблюдение за больным показало, что через 3 года после энуклеации появились метастазы в печени.

Пример 2. Пациент П., 46 лет обратился с жалобами на появление искажения формы предметов перед правым глазом.

Проведенные офтальмологические исследования:

Визометрия: Visus OD - 0,2 н.к.,

VisusOS - 1,0.

Тонометрия: ВГД OD - 18 мм. рт.ст., OS - 18 мм. рт.ст.

Биомикроскопия: OD - спокоен, среды прозрачны,

Прямая офтальмоскопия:

OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. Юкстапапиллярно с распространением на зону ДЗН по меридианам с 12 до 15 часов определяется проминирующее образование аспидного цвета, с нечеткими, неровными границами, гладкой поверхностью. Вторичная отслойка сетчатки над опухолью и в нижних отделах глазного дна.

OS - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.

Эхография:

OD -«+»- ткань с проминенцией 4,5 мм, диаметром основания 16 мм,

OS -«+» - ткань не определяется.

В связи с папиллярной локализацией опухоли независимо от ее размеров по данным УЗИ, проведена энуклеация правого глаза.

Проведены патоморфологические исследования. Выявлен смешанноклеточный тип УМ, в микроокружении опухоли диагностирована 1 тучная клетка с выявлением опухолевых клеток в просвете эмиссария. Наблюдение за больным в течение 3 лет показало, что метастазы в печени отсутствовали, что указывает на адекватность прогнозирования тяжести течения УМ предложенным способом.

Полученные данные указывают на необходимость проведения прогнозирования тяжелого течения УМ для выбора соответствующей тактики лечения.

Таким образом, способ позволяет более точно оценить течение УМ с целью прогнозирования заболевания.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. Для прогнозирования тяжелого течения увеальной меланомы проводят патоморфологическое исследование микроокружения опухоли энуклеированного глаза. При выявлении в нем 6 и более тучных клеток и наличии опухолевых клеток в просвете хотя бы одного эмиссария прогнозируют тяжелое течение увеальной меланомы. Способ обеспечивает повышение точности определения тяжести течения увеальной меланомы за счет проведения патоморфологического исследования. 2 пр.

Способ прогнозирования тяжелого течения увеальной меланомы, отличающийся тем, что проводят патоморфологическое исследование микроокружения опухоли энуклеированного глаза и при выявлении в нем 6 и более тучных клеток и наличии опухолевых клеток в просвете хотя бы одного эмиссария прогнозируют тяжелое течение увеальной меланомы.