СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНГИЦИДА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2003 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к способам производства биологических средств защиты растений и может быть использовано в микробиологической промышленности, а получаемые препараты - в сельском хозяйстве для фунгицидного угнетения возбудителей микозов растений.

В микробиометоде зашиты растений от микозов известны различные способы получения микробиопрепаратов на основе микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности: разработана технология их получения на твердых питательных средах (триходермин-1, -2, -3, -4), и культивирование глубинным способом на жидких питательных средах (боверин, триходермин, ризоплан и др.).

Известен способ получения биоцида, в частности боверина, включающий культивирование микроорганизмов в глубинных условиях, концентрирование биомассы путем осаждения и высушивания в псевдоожиженном слое (а.с. СССР 738571, М. кл. A 01 N 15/00, 1978).

Известен также способ получения биоцида (боверина), включающий культивирование микроорганизмов на жидкой питательной среде в ферментерах, отделение биомассы от культуральной жидкости фильтрованием на нутч-фильтре или фильтр-прессе (а. с. СССР 313531, М. кл. А 01 N 15/00, 1970) - ближайший аналог.

Хотя глубинные способы получения биоцидов более рациональны по сравнению с поверхностными, но и они не лишены недостатков.

Основным недостатком известных способов является низкая вирулентность получаемых микробиопрепаратов из-за малой концентрации в конечном продукте биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, витаминов и др.), играющих основную роль в создании биохимического прессинга на обитателей экониши. Кроме того, микробиопрепараты в жидкостной форме представляют собой мицелиальную биомассу и наполнители. Поэтому их водные суспензии быстро забивают форсунки распылительных устройств, создавая трудности при обработке растений.

Задачей настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, а именно повышение вирулентности микробиопрепаратов и обеспечение технологичности их применения.

Эта задача решается тем, что в способе получения фунгицида по первому варианту, включающем глубинное культивирование микроорганизмов на жидкой питательной среде в ферментерах и отделение биомассы от культуральной жидкости, культивируют гриб-фитопатоген или ряд грибов-фитопатогенов в смешанном виде, после отделения биомассы от культуральной жидкости последнюю очищают от взвешенной фазы микрофильтрацией, после чего полученный раствор биологически активных веществ концентрируют посредством диализа. В способе получения биоцидов по второму варианту грибы-фитопатогены культивируют отдельно один от другого, а после отделения биомассы каждого гриба от культуральной жидкости каждую культуральную жидкость очищают от взвешенной фазы микрофильтрацией, после чего полученные растворы биологически активных веществ отдельно один от другого концентрируют посредством диализа, а затем смешивают. При этом при реализации обоих вариантов способа микрофильтрацию осуществляю дальтон, а диализ осуществляют на установке с разрешающей способностью .

Сущность изобретения заключается в том, что появляется возможность регулировать осуществление количественного и качественного прессинга на обитателей экониши, имитируя фунгистазис почвы.

Применение смешанных культур грибов-фитопатогенов, таких как антагонисты родов Trichoderma, Fusarium, Alternaria, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Botrytis и др. (до 10 видов) расширяет спектр действия биоцидов, а сконцентрированные биологически активные вещества с продуктами метаболизма фитопатогенов (глиотоксин, виридин и др.) повышают фунгицидную активность биоцидов в 2-3 раза по сравнению с фунгицидной активностью культуральных жидкостей. Предпочтительно введение в смешанную культуру гиперпаразита рода Trichoderma как высококонкурентного антагониста возбудителей микозов растений.

Высокая технологичность применения биоцидов, получаемых по предлагаемому способу, обусловлена тем, что на конечном этапе микробиопрепарат представляет собой их истинный высокоактивный водный раствор.

Пример 1 (1-й вариант способа).

Монокультуру Trichoderma lignorum выращивают глубинным методом на отваре ячменного размола с расходом 50 г на 1 л отвара. В ферментеры вместимостью 100 и 1000 л вносят соответственно 70 и 700 л отвара с рН 6 и стерилизуют при 120^oС в течение 1 часа. Ферментеры с питательной средой захолаживают, вносят инокулюм (споровую суспензию или глубинную культуру - 10% от объема среды), приготовленный в инокуляторах вместимостью 10 и 100 л. Культивируют в течение 24-48 часов при температуре 27-28^oС. Готовую культуру сливают в емкость макрофильтров, где происходит отделение культуральной жидкости от грибной биомассы. Культуральная жидкость (90% культуры) поступает в отстойник в виде мутной суспензии, которую посредством сжатого воздуха подают в УМТ-6 (установка микрофильтрации трубчатая), отделяющую суспендированные частицы от молекулярного раствора, биологически активных веществ с разрешающей способностью до 15 тысяч дальтон. В результате получают прозрачный молекулярный раствор биологически активных веществ. Из сборника УМТ-6 раствор подают на диализную установку с разрешающей способностью 10 , где осуществляют концентрированно раствора под давлением 2 ат.

В результате получают высокоактивный концентрат биологически активных веществ, используемый для ингибирования микозов при вегетации растений и для предпосевного протравливания семян, а также активную концентрированную биомассу (мицелий с хламидоспорами) для внесения в почвенные экониши.

Пример 2 (1-й вариант способа). Используют биотехнологию смешанных культур грибов-почвообитателей Trichoderma lignorum, Fusarium graminearum, Aspergillus repeus, Botrytis cinerea, Penicillium chrisogenum. На первом этапе получают споровые или глубинные суспензии монокультур указанных грибов в качестве инокулюма. Готовят питательную среду из отвара злаковых размолов (овес, ячмень, пшеница, рожь) с расходом 50 г на 1 л отвара. Отвары монокультур с рН 6 вносят в ферментеры вместимостью 100 и 1000 л и стерилизуют при 120^oC в течение 1 часа. Ферментеры с питательной средой захолаживают, вносят инокулюм в количестве 10% от объема среды. Культивируют в течение 24-48 часов при температуре 27-28^oС. Развитие смешанной культуры в объеме одного реактора обуславливается пороговым аддитивным ингибированием продуктами метаболизма, моделирующими естественный фунгистазис экониш их обитания. Готовую культуру подвергают дальнейшей технологической переработке: последовательной фильтрации и концентрированию согласно примеру 1.

Пример 3 (2-й вариант способа). По технологии, указанной в примере 1, последовательно готовят каждую культуру грибов-фитопатогенов: Fusarium graminearium, Aspergillus repeus, Penicillium chrisogenum. Приготовленные концентраты культур грибов смешивают в равных пропорциях в специальной емкости.

Во всех примерах вирулентность концентрата проверяют методом бумажных дисков на питательном агаре, где тест-культурой является гриб-фитопатоген Botrytis cinerea.

Преимуществом способа получения биоцидов в монокультуре по сравнению со способом получения биоцидов смешанных культур является то, что он позволяет достичь максимальной плотности биологически активных веществ в культуре, а недостатком - необходимость наличия нескольких реакторов для одновременного культивирования ряда грибов либо длительность технологического процесса при наличии одного реактора.

Пределы разрешающей способности установки микрофильтрации обусловлены необходимостью очищения растворов биоцидов от всех ингредиентов субклеточных структур (субсидированных микрочастиц).

Пределы разрешающей способности диализной установки выбраны исходя из минимальных объемных размеров молекул биоцидов.

С помощью предлагаемого способа начальные активности глиотоксина (3,76 единиц на 1 мл культуральной жидкости) и виридина (0,006 единиц на 1 мл культуральной жидкости), были повышены в концентрате примерно в 3 раза.

Изобретение относится к способам производства биологических средств защиты растений и может быть использовано в микробиологической промышленности, а получаемые препараты - в сельском хозяйстве для фунгицидного угнетения возбудителей микозов растений. По первому варианту способа в ферментерах на жидкой питательной среде культивируют гриб-фитопатоген или ряд грибов-фитопатогенов в смешанном виде, после отделения биомассы от культуральной жидкости последнюю очищают микрофильтрацией на установке с резрешающей способностью 15-100 тысяч дальтон, после чего полученный раствор биологически активных веществ концентрируют посредством диализа на установке с разрешающей способностью . Во втором варианте способа указанные операции проводят отдельно для каждой культуры грибов-фитопатогенов, а в заключение концентраты их биологически активных веществ смешивают. Изобретение позволяет повысить вирулентность микробиопрепаратов, регулировать осуществление количественного и качественного прессинга на обитателей экониши, имитируя фунгистазис почвы. 2 с.п. ф-лы.

1. Способ получения фунгицида, включающий глубинное культивирование гриба-фитопатогена на жидкой питательной среде в ферментерах, фильтрацию и концентрирование культуральной жидкости, отличающийся тем, что культивируют гриб-фитопатоген или ряд грибов-фитопатогенов в смешанном виде, отделяют биомассу от культуральной жидкости, затем последнюю очищают от взвешенной фазы микрофильтрацией на установке с разрешающей способностью 15-100 тысяч дальтон, после чего полученный раствор биологически активных веществ концентрируют посредством диализа на установке с разрешающей способностью 5-10 . 2. Способ получения фунгицида, включающий глубинное культивирование гриба-фитопатогена на жидкой питательной среде в ферментерах, фильтрацию и концентрирование культуральной жидкости, отличающийся тем, что культивируют грибы-фитопатогены отдельно один от другого, отделяют биомассу каждого гриба от культуральной жидкости, каждую культуральную жидкость очищают от взвешенной фазы микрофильтрацией на установке с разрешающей способностью 15-100 тысяч дальтон, после чего полученные растворы биологически активных веществ отдельно один от другого концентрируют посредством диализа на установке с разрешающей способностью 5-10 , а затем смешивают.