СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛА В МОЧЕ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/84 

Изобретение относится к области медицинских и токсикологических исследований, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения фенола в биологических жидкостях, в частности в моче.

Известен способ определения фенолов в paпe, согласно которому производят экстракцию фенола из анализируемой пробы жидкости смесью трибутилфосфата и цетилового спирта при массовом соотношении компонентов 35,4-61,2:64,6-38,8 с последующим газохроматографическим анализом полученного экстракта [1].

Однако известным способом возможно определение фенолов лишь в природных жидкостях. Использование же его для определения фенола в биологических средах приводит к большим погрешностям.

Также известен способ определения количества фенольных компонентов в растворах пищевых продуктов, который включает приготовление раствора пищевого продукта, обработку экстрагентом (эфиром уксусной кислоты и полисорбом), выделение фенольных компонентов путем их реэкстракции водным раствором гидроксида щелочного металла при рН 12,5-13 и фотометрирование этих фенольных компонентов [2].

Недостатком указанного известного способа является его недостаточная точность вследствие наличия двухэтапного (экстракция и реэкстракция) выделения фенольных компонентов.

В практике используется метод качественного определения фенола в моче людей, отравленных фенолом (в несвязанном виде). Для изолирования несвязанного фенола из мочи ее подкисляют слабым раствором уксусной кислоты, а затем фенол отгоняют с водяным паром. Для обнаружения фенола используют часть третьего дистиллята, который вносят в делительную воронку, прибавляют раствор гидрокарбоната натрия до щелочной реакции. Содержимое делительной воронки 2-3 раза взбалтывают с несколькими порциями диэтилового эфира по 10 см³. Эфирные вытяжки соединят вместе и при комнатной температуре выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2-3 см³ воды. Полученный раствор используют для обнаружения фенола при помощи реакций образования трибромфенола, индофенола, а также реакций с хлоридом железа (III), реактивом Миллона [3].

Реакции, используемые при осуществлении указанного известного способа, характерны для всех фенолсодержащих соединений и вследствие этого позволяют проводить только качественное определение фенола.

Наиболее близким к предлагаемому способу по назначению является газохроматографический способ количественного определения фенола в моче, согласно которому к пробе мочи добавляют 0,2 см³ концентрированной соляной кислоты, 0,4 г хлорида натрия, пробу термостатируют при 100^oС в течение 1,5 часов и затем паровую фазу вводят в хроматограф. При этом газохроматографическое определение фенола проводят на стальной колонке длиной 2,5 м и внутренним диаметром 3 мм, заполненную полиметилфенилсилоксановой жидкостью, нанесенной на хроматон N-AW в количестве 15%. Рабочий режим хроматографа: температура термостата колонок 130^oС, испарителя - 180^oС, расход расход газа-носителя 40 см³/мин, воздуха - 400 см³/мин•см³ [4].

Недостатком указанного известного способа является невысокая чувствительность, а именно граница обнаружения фенола составляет 3 мкг/см³.

Техническая задача, решаемая предлагаемым способом, заключается в повышении чувствительности и точности определения фенола в моче.

Указанная техническая задача решается заявляемым способом, согласно которому производят последовательное регулирование рН пробы мочи карбонатом натрия до рН 8-10, введение в пробу ацилирующего реагента - уксусного ангидрида, экстракцию метиленхлоридом при соотношении метиленхлорид: уксусный ангидрид: карбонат натрия как (1,0-5,0) об.ч: (0,25-0,3) об.ч: (1,5-2,0) мас. ч, нагревание выделенного экстракта до температуры 40-60^oС и выдержку в течение не менее 20 с, центрифугирование и проведение определения фенола газохроматографическим методом.

Экспериментально было обнаружено, что применение в качестве экстрагента метиленхлорида позволяет более полно извлечь фенол из мочи, что повышает чувствительность предлагаемого способа (таблица 1).

Оптимальный эффект наблюдается при использовании в качестве экстрагента метиленхлорида, нагревании экстракта при температуре 40-60^oС и выдержке его при этой температуре не менее 20 секунд. Нагревание в течение меньшего диапазона времени недостаточно для полной денатурации белковых веществ в пробах (таблица 2).

Прямой газохроматографический анализ фенолов, особенно следовых количеств, осложнен высокой полярностью и достаточно сильной кислотностью фенола, а также низким давлением паров. Улучшить газохроматографические свойства фенола оказалось возможным путем превращения его в менее полярные соединения, не склонные к ассоциации за счет образования водородных связей. Это достигается в предлагаемом способе путем получения производных фенола по гидроксильным группам. Превращение фенола в сложные эфиры путем ацилирования уксусным ангидридом представляет собой один из простейших способов превращения фенола в производные для газохроматографического анализа.

Экспериментально также была изучена зависимость степени экстракции фенола из мочи в зависимости от различных объемных соотношений экстрагента, ацилирующего реагента и количества карбоната натрия (таблица 3).

Данные таблицы 3 показывают, что только при определенном соотношении количеств используемых при осуществлении предлагаемого способа метиленхлорида, уксусного ангидрида и карбоната натрия обеспечивается высокая степень экстракции фенола из мочи, что способствует повышению точности и чувствительности способа.

Предлагаемый способ определения заключается в следующем:
- к 50 см³ мочи, содержащей фенол, добавляют кристаллический карбонат натрия до рН 8-10;
- содержимое перемешивают плавным покачиванием;
- далее в пробу вводят ацилирующий реагент - уксусный ангидрид - и встряхивают в течение 5 минут для перевода фенола в уксуснокислый эфир;
- продукт ацилирования экстрагируют метиленхлоридом (например, дважды) в течение 2 минут, при этом все используемые при осуществлении предлагаемого способа компоненты берут в следующих соотношениях: метиленхлорид: уксусный ангидрид: карбонат натрия как (1,0-5,0) об.ч: (0,25-0,3) об.ч: (1,5-2,0) мас.ч;
- затем экстракт выделяют, нагревают его до температуры 40-60^oС, выдерживают при этой температуре не менее 20 секунд для осаждения из мочи белковых веществ, аминокислот, липидов, мешающих определению фенола;
- затем экстракт центрифугируют со скоростью 3600 об/мин;
- количественное определение фенола осуществляют газохроматографическим методом путем установления коэффициентов пересчета фенола по отношению к внутреннему стандарту. Для этого используют пробы мочи, отобранные у контрольной группы детей, с добавлением в эти пробы различного содержания фенола. После их исследования по предлагаемому способу производят их хроматографирование не менее 5 раз на приборе ЛХМ-8МД с детектором ионизации в пламени. Анализ осуществляют на стальной колонке длиной 3 м и диаметром 3 мм, заполненной хроматоном N-AW-DMCS с нанесенной неподвижной жидкой фазой 5% OV-1. Режим работы хроматографа: температура термостата колонок - 110^oС, испарителя - 170^oС, детектора - 170^oС, скорость газа-носителя (гелий) - 33 см³/мин. Расчет количественного содержания фенола осуществляют по площадям пиков на хроматограмме с использованием внутреннего стандарта в биопробах 1-5. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Исследования показали, что чувствительность определения фенола в моче предлагаемым способом составила 0,038 мкг/см³. Возможно определение фенола 0,0004 мкг в анализируемом объеме пробы мочи. При этом погрешность определения составила 23,53% (таблица 5).

Таким образом, предлагаемым способом можно с высокой степенью точности и чувствительности определять фенол в моче.

Применение предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения по фенолу по сравнению с прототипом в 80 раз.

Источники информации
1. Авт. свид. СССР 1608571, кл. G 01 N 30/04, 1988 г.

2. Авт. свид. СССР 1661641, кл. G 01 N 30/00, 1989 г.

3. И.Д. Гадаскина, Н.Д. Гадаскин, В.А. Филов. Превращение и определение промышленных органических ядов в организме. - М.: Медицина, 1970 г., с. 40.

4. М.Т. Дмитриев, Ю.Б. Суворова. Газохроматографическое определение фенола в моче, журнал "Гигиена и санитария", 1989 г., 10.

Изобретение относится к области медицины, в частности к санитарной токсикологии. Способ обеспечивает повышение чувствительности и точности определения фенола в моче. Производят регулирование рН пробы мочи и определение количества фенола газохроматографическим методом, при этом регулирование рН пробы мочи осуществляют карбонатом натрия до рН 8-10, далее в пробу вводят ацилирующий реагент - уксусный ангидрид, производят экстракцию метиленхлоридом при отношении метиленхлорид: уксусный ангидрид: карбонат натрия как 1,0-5,0 об.ч.: 0,25-0,3 об.ч.: 1,5-2,0 мас.ч., выделенный экстракт нагревают до температуры 40-60^oС, выдерживают при этой температуре не менее 20 с, центрифугируют и осуществляют определение фенола газохроматографическим методом. 1 з.п.ф-лы, 5 табл.

1. Способ количественного определения фенола в моче, включающий регулирование рН пробы мочи и определение количества фенола последующим газохроматографическим анализом, отличающийся тем, что регулирование рН пробы мочи осуществляют карбонатом натрия до рН 8÷10, далее в пробу вводят ацилирующий реагент - уксусный ангидрид, производят экстракцию метиленхлоридом при соотношении метиленхлорид: уксусный ангидрид: карбонат натрия как 1,0÷0,5 об. ч. : 0,25÷0,3 об. ч. : 1,5-2,0 мас. ч. , выделенный экстракт нагревают до температуры 40-60^oС, выдерживают при этой температуре не менее 20 с, центрифугируют и осуществляют определение фенола газохроматографическим методом. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию метиленхлоридом производят дважды.