СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОЛА В КРОВИ Российский патент 2002 года по МПК G01N30/00 

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения фенола в биологических жидкостях, в частности в крови.

Известен колориметрический метод определения фенола в плазме крови [1]. Согласно известному способу в колбе для перегонки вместимостью 75-100 см³ смешивают 1 см³ плазмы с 5 см³ 0,22 н. Н₂SO₄ (кислота используется для разрушения комплексов фенола с белками). Смесь нагревают до температуры кипения и перегоняют водяным паром в градуированную емкость, собирая 4 см³ конденсата. К 3,5 см³ отогнанного раствора добавляют 0,2 см³ аммиачного буфера, 0,02 см³ 7%-го раствора пирамидона в этаноле и 0,2 см³ 25%-го водяного раствора феррицианата калия. Пробирку встряхивают и раствор фотометрируют через 15 мин. При 490 нм (зеленый фильтр). Концентрацию фенола в пробе определяют по калибровочному графику. Диапазон определяемых концентраций фенола составляет 0,15-24 мкг/см³.

Недостатком указанного известного способа является его недостаточная точность и чувствительность.

Также известен способ определения фенола в крови путем отгонки свободного фенола с водяным паром и его спектрофотометрического определения в дистилляте [2].

Сущность указанного известного метода заключается в следующем. В дистилляционную колбу помещают 10 см³ анализируемой крови с 5 см³ раствора лимоннокислого натрия. Подкисляют 10 см³ винной кислоты и добавляют 3 см³ раствора сульфата кадмия. Присоединяют колбу с пробкой к установке, закрывают среднюю трубку парообразователя, доводят воду в нем до сильного кипения и производят дистилляцию с водяным паром со скоростью 8-10 см³ дистиллята в минуту. Отбор дистиллята ведут в 100-миллилитровый мерный цилиндр. Собирают 2 порции дистиллята, каждая по 86 см³. Вторая порция должна содержать не более 25% фенола от количества его в первой.

В полученных дистиллятах могут присутствовать липоидные вещества, мешающие дальнейшему анализу из-за образующейся мути. Для их удаления каждую порцию дистиллята тщательно взбалтывают с 4 г окиси алюминия. К образовавшейся суспензии добавляют по 10 см³ боратного буфера, перемешивают, вносят по 4 см³ хромогенного реактива и после встряхивания оставляют на час. Через час центрифугируют дистиллят, а затем фотометрируют относительно воды в области 620 нм.

Обнаруживаемая концентрация фенола в крови указанным способом составляет 3,5 мкг/см³, что является низким показателем чувствительности.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является газохроматографический способ количественного определения фенола в сыворотке крови [3]. Известный способ по очистке сыворотки включает перегонку, экстракцию фенолов из дистиллятов хлороформом и последующий газохроматографический анализ концентрированных растворов фенола в хлороформе.

Газохроматографический анализ по указанному известному способу проводят на хроматографе "Цвет-102", снабженном пламенно-ионизационным детектором, стеклянными колонками длиной 1 м. В качестве сорбента используют хроматон N-AW-DMCS с нанесенным на него динонилфталатом в жидкой фазе.

Точность указанного известного способа составляет ±8%. Диапазон измеряемых концентраций фенола в сыворотке крови составил 0,5-2,3 мкг/см³.

К недостаткам известного способа относится его недостаточная чувствительность.

Изобретением решается задача повышения чувствительности способа при одновременном сохранении высокой точности.

Для достижения названного технического результата в предлагаемом способе, включающем экстракцию фенола органическим экстрагентом и определение фенола в полученном экстракте газохроматографическим анализом, перед экстракцией в пробу крови добавляют последовательно карбонат натрия и йодистый метил, далее при экстракции в качестве органического экстрагента используют диэтиловый эфир при соотношении экстрагент : йодистый метил : карбонат натрия как (2,0-10,0) об. ч. : (0,25-0,3) об.ч. : (1,5-2,0) мас.ч. соответственно, а перед газохроматографическим анализом полученного экстракта последний нагревают до температуры +35÷40^oС, выдерживают при этой температуре 9-12 с и центрифугируют.

Отличительными признаками заявляемого способа является применение экстракционного концентрирования деривата фенола - метилфенилового эфира из крови из щелочной среды с использованием дополнительных факторов (нагревание до температуры +35÷40^oС, выдержка и центрифугирование), повышающих эффективность экстракционной системы, с последующим газохроматографическим анализом концентрата. При этом количественное определение фенола проводят методом внутреннего стандарта.

Экспериментальным путем было обнаружено, что применение в качестве экстрагента диэтилового эфира позволяет более полно извлечь фенол из пробы крови, что повышает чувствительность способа. Результаты этих исследований приведены в таблице 1.

Оптимальный эффект извлечения фенола из крови наблюдается при использовании в качестве экстрагента диэтилового эфира и нагревании экстракта при температуре +35÷40^oС в течение 9-12 с.

Данные об этих исследованиях приведены в таблице 2.

Превращение фенола в простые и стойкие эфиры путем метилирования представляет собой один из простейших способов перевода с помощью йодистого метила в производные для газохроматографического анализа.

Изучена зависимость степени экстракции фенола из крови в предлагаемом способе от различных объемных соотношений экстрагента, метилирующего агента (йодистого метила) и количества карбоната натрия.

Данные об установленной зависимости представлены в таблице 3.

Экспериментальным путем было установлено, что в предлагаемом способе более полно извлекать фенол из крови (до 96%) возможно лишь при следующем соотношении используемых реагентов, а именно экстрагент : йодистый метил : карбонат натрия как (2,0-10,0) об.ч. : (0,25-0,3) об.ч. : (1,5-2) мас.ч соответственно.

Предлагаемый способ осуществляется в следующей последовательности:
- берут пробу крови объемом 2 см³;
- доводят ее бидистиллированной водой до 50 см³;
- добавляют в пробу карбонат натрия;
- далее вводят йодистый метил и встряхивают для перевода фенола в метилфениловый эфир;
- осуществляют экстракцию диэтиловым эфиром при следующем соотношении реагентов: экстрагент (2,0-10,0 об.ч.) : йодистый метил (0,25-0,3 об.ч.) : карбонат натрия (1,5-2 мас.ч.);
- выделенный экстракт нагревают до температуры +35÷40^oС;
- выдерживают при этой температуре в течение 9-12 с;
- затем экстракт центрифугируют со скоростью 7000 об/мин;
- проводят газохроматографический анализ и расчет количественного содержания фенола осуществляют по площадям пиков на гематограмме с использованием внутреннего стандарта.

Пример конкретного выполнения.

Анализируют пробы крови (контрольная группа детей) с различным содержанием в них фенола. Анализ проводят по следующей схеме: 2 см³ пробы крови, содержащей заданную концентрацию фенола, доводят до 50 см³ бидистиллированной водой, переносят в делительную воронку объемом 250 см³ и добавляют 2 г кристаллического карбоната натрия (для создания щелочной среды рН 8). Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят 0,3 см³ йодистого метила и перемешивают в течение 5 мин для перевода фенола в метилфениловый эфир. Продукт метилирования экстрагируют диэтиловым эфиром в течение 5 мин при следующих соотношениях: экстрагент (2,0-10,0), метилирующий агент (0,25-0,3), карбонат натрия (1,5-2 г). Для денатурации белковых веществ полученные экстракты нагревают при температуре +35÷40^oС в течение 10 с, а затем центрифугируют при 7000 об/мин в течение 5 мин. Полученные экстракты хроматографируют 5 раз на хроматографе ЛХМ-8МД с детектором ионизации в пламени. Анализ осуществляют на стальной колонке длинной 3 м, диаметром 3 мм, заполненной хроматоном N-AW-DMCS с нанесенной неподвижной жидкой фазой 5% OV-1. Режим работы прибора: температура термостата колонок - 110^oС, температура детектора - 170^oС, испарителя - 170^oС, скорость газа-носителя (гелий) - 33 см³/мин. Расчет количественного содержания фенола осуществляют по площадям пиков на гематограмме с использованием внутреннего стандарта в биопробах 1-5.

Полученные результаты приведены в таблице 4.

Чувствительность определения фенола в крови предложенным способом составила 0,008 мкг/см³. Возможно также определение фенола 0,00008 мкг в анализе объема пробы.

Погрешность определения по предложенному способу составляет 14,9-24,81%. Данные об этом приведены в таблице 5.

Таким образом, предлагаемым способом можно с высокой степенью точности и чувствительности определить фенол в крови. Применение предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения по фенолу в 100 раз.

Источники информации
1. Захарченко В.Н., Погочанский В.А. Колориметрическое определение фенола в плазме крови. Ж. "Лабораторное дело", 9, 1983.

2. Гадаскина И.Д. и др. Превращение и определение промышленных органических ядов в организме. Л.: Медицина, 1971.

3. Кочетова Н.Н., Лурье Б.Л., Агнохов Х.Б. Некоторые аспекты лечения гемосорбцией первичного билиарного цирроза (удаление фенолов). Труды института им. М.Ф.Владимирского, XXXI, Москва, 1981 (прототип).

Использование: изобретение относится к области медицинских, токсикологических исследований, в частности к санитарной токсикологии. Сущность: согласно предлагаемому способу в пробу крови добавляют последовательно карбонат натрия и йодистый метил, далее производят экстракцию диэтиловым эфиром при соотношении экстрагент : йодистый метил : карбонат натрия как (2,0-10,0) об.ч. : (0,25-0,3) об.ч. : (1,5-2,0) мас.ч. соответственно, затем полученный экстракт нагревают до температуры 35-40^oС, выдерживают при этой температуре 9-12 с, центрифугируют и осуществляют определение фенола газохроматографическим методом. Технический результат: повышение чувствительности при сохранении высокой точности определения. 5 табл.

Способ количественного определения фенола в крови, включающий экстракцию фенола органическим экстрагентом и определение фенола в полученном экстракте газохроматографическим анализом, отличающийся тем, что перед экстракцией в пробу крови добавляют последовательно карбонат натрия и йодистый метил, далее при экстракции в качестве органического экстрагента используют диэтиловый эфир при соотношении экстрагент : йодистый метил : карбонат натрия как (2,0-10,0) об.ч. : (0,25-0,3) об.ч. : (1,5-2,0) мас.ч. соответственно, а перед газохроматографическим анализом полученного экстракта последний нагревают до температуры +35-40^oС, выдерживают при этой температуре 9-12 с и центрифугируют.