СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/84 

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинским, токсикологическим исследованиям, и может быть использовано при диагностике экологически обусловленной патологии, вызванной тяжелыми металлами, в лабораториях биохимии, специализированных учреждениях и клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений.

Большая часть современных методов определения тяжелых металлов, в частности марганца, свинца, меди, цинка, хрома и никеля в биоматериалах, основана на спектрофотометрическом, полярографическом и фотометрическом определении с предварительным экстракционным отделением и концентрированием металлов (1).

Основными недостатками этих известных методов являются необходимость отделения определяемых ионов от мешающих ионов, что связано с процессами многократных экстракций и реэкстракций, что снижает точность определения. Кроме того, эти известные способы обеспечивают сравнительно низкую чувствительность для ряда элементов и характеризуются большой трудоемкостью.

Известен также атомно-абсорбционный способ определения никеля в биоматериале (2). Согласно этому известному способу определение никеля в биоматериале (ткани органов, моча, кал) осуществляют после мокрого озоления биопробы. Ошибка определения при этом составляет 10% без учета пробоподготовки. Предел чувствительности определения никеля - 0,05 мкг/мл.

Недостатком указанного известного способа является его недостаточная чувствительность, узкий спектр определяемых компонентов (только никель), высокая погрешность определения (>10%, без учета пробоподготовки).

Также известен способ количественного определения свинца в крови (3), согласно которому проводят предварительное концентрирование и извлечение свинца из крови. Пробу крови объемом не менее 6 мл помещают в колбу на 10 мл, добавляют 1 мл комплексообразователя - 10%-ного раствора Triton Х-100, 1 мл 2% раствора аммоний пиролидин дитиокарбамата. Затем добавляют 0,05 мл 1,5 М раствора CaC1₂, тщательно встряхивают после каждого этапа. Добавляют 1,5 мл метилизобутилкетона (водорастворимого), встряхивают в течение 5 минут и потом добавляют 5 мл бидистиллированной воды. Центрифугируют на 700 оборотах в течение 10 минут. Для анализа берут верхний органический слой.

Приготовление стандартных образцов для анализа проводят с использованием аналогичного процесса экстракции, за исключением времени центрифугирования (20 мин).

Недостатком указанного способа являются высокая погрешность определения (>25%) и узкий спектр определяемых компонентов (только свинец), сравнительно большой объем биоматериала для анализа (6 мл крови).

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по совокупности признаков является способ количественного определения свинца, согласно которому производят обработку исследуемой пробы 5%-ным раствором уксусной кислоты, последующее озоление ее при температуре 400-450^oС, обработку полученной золы концентрированной соляной кислотой, выпаривание до состояния влажных солей, введение фонового электролита - смеси ортофосфорной и хлорной кислот, и определение содержания металлов с помощью полярографии (4).

Однако указанный известный способ имеет недостаточную точность, а также узкий спектр определяемых компонентов (только свинец).

Предлагаемое изобретение решает техническую задачу повышения точности определения, расширения спектра определяемых компонентов из одной пробы до шести при их совместном присутствии (марганец, свинец, никель, цинк, медь, хром), уменьшение объема биоматериала для анализа.

Поставленная техническая задача достигается способом определения тяжелых металлов в цельной крови, включающем обработку исследуемой пробы кислотой, последующее озоление ее, обработку полученной золы концентрированной минеральной кислотой, выпаривание до состояния влажных солей, введение фонового раствора и определение содержания металлов с помощью инструментального метода, при этом новым является то, что в качестве кислоты для обработки исследуемой пробы и в качестве фонового электролита используют 0,5-5,0%-ный водный раствор азотной кислоты при объемном соотношении проба : кислота как 1: 1, при этом перед озолением пробу подсушивают в два этапа при температуре 110^oС и 250^oС, озоление ведут при температуре 430^oС, в качестве концентрированной минеральной кислоты для обработки полученной золы используют концентрированную азотную кислоту, а в качестве инструментального метода используют атомно-абсорбционную спектрофотометрию.

При этом время подсушивания пробы на каждом из этапов при температуре 110^oС и при температуре 250^oC составляет не менее 1,5 ч.

Экспериментальным путем было установлено, что только применение в качестве конечной температуру озоления 430^oС с предварительной обработкой пробы крови 0,5-5,0%-ной азотной кислотой (оптимальный вариант 1%-ный раствор кислоты) повышает точность определения.

Данные о погрешности определения металлов при разных температурах озоления крови представлены в табл. 1.

Данные, представленные в табл.1, показывают, что оптимальный эффект наблюдается при использовании в качестве конечной температуры озоления 430^oС с добавкой 1% НNО₃ в объемном соотношении проба : кислота как 1:1, т.к. исследуемые компоненты (марганец, свинец, медь, хром, цинк, никель) определяются с более высокой точностью (погрешность определения 19,16%).

Для более полного озоления проб крови при температуре 430^oС используют раствор азотной кислоты в объемном соотношении проба: кислота, как 1:1. Экспериментально установлена концентрация и объем добавки, необходимый для более полного озоления пробы крови (табл. 2).

Данные, приведенные в табл. 2, показывают, что только при обработке пробы крови 0,5-5,0%-ным раствором азотной кислоты (оптимальная концентрация - 1%-ный раствор азотной кислоты) в объемном соотношении проба крови : раствор кислоты как 1:1 обеспечивается более точное определение содержания тяжелых металлов.

При осуществлении предлагаемого способа проводят следующие операции в нижеуказанной последовательности:
отбирают 1 мл цельной крови в тигель;
обрабатывают пробу 1 мл 0,5-5,0%-ной азотной кислоты (оптимальная концентрация 1%-ная);
сушат в муфельной печи при температуре 110^oС в течение 1,5 часа;
выдерживают пробу при температуре 250^oС в течение 1,5 часа;
далее пробу озоляют при температуре 430^oС в течение 3 часов;
после остывания к зольному остатку добавляют 0,3 мл концентрированной азотной кислоты и оставляют на 30 минут;
выпаривают пробу до состояния "влажных солей" и после остывания разводят 5 мл 0,5-5,0%-ным раствором азотной кислоты;
определяют содержания металлов с использованием калибровочного графика методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии.

Пример 1.

Брали 1 мл пробы крови, содержащей исследуемые металлы. В эту пробу добавляли 1 мл 1%-ной азотной кислоты. Пробу помещали в муфель и выдерживали в течение 1,5 часа при температуре 110^oС, затем при температуре 250^oС - также 1,5 ч и далее при температуре 430^oС - 3 часа. Полученный зольный остаток растворяли в 0,3 мл концентрированной азотной кислоты и оставляли на 30 мин. Пробы выпаривали на песочной бане до состояния влажных солей и после остывания разводили в 5 мл 1%-ной азотной кислоты и переносили в пробирку для анализа. Анализ осуществляли на атомно-абсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer 3110 с атомизацией в пламени.

В результате проведенных лабораторных исследований было установлено, что нижний предел обнаружения исследуемых металлов в крови предложенным способом составляет: марганец - 0,010 мкг/мл; свинец - 0,05 мкг/мл; хром - 0,01 мкг/мл; никель - 0,05 мкг/мл; медь - 0,100 мкг/мл; цинк - 0,50 мкг/мл.

Также в ходе лабораторных исследований устанавливали точность определения (относительную погрешность) предлагаемым способом исследуемых металлов в крови при их совместном присутствии. Данные об этом приведены в табл. 3.

Данные, приведенные в табл. 3, показывают, что погрешность определения предлагаемым способом составляет для свинца 9,69%, марганца - 19,16%, хрома - 9,69%, меди - 15,53%, цинка - 2,70%, никеля - 18,21%, в то время как погрешность анализа (для свинца) по известному способу, наиболее близкому к предлагаемому по назначению (но далекому по совокупности признаков) и описанному в источнике информации 3, составляет 15,63%. Использование предлагаемого способа позволяет повысить по сравнению с этим способом точность определения для свинца в 1,6 раза, расширить спектр определяемых компонентов (всего 6 металлов), уменьшить объем биоматериала (крови) для анализа в 6 раз.

Таким образом, предлагаемым способом можно с высокой степенью точности и чувствительности определять марганец, свинец, цинк, никель, медь и хром при их совместном присутствии в пробах крови.

Источники информации:
1. Л. И. Текуцкая, Л. И.Софьина "Методы и практика контроля содержания тяжелых металлов в биосредах" // Гигиена и санитария, 1999 г., 5, с. 24.

2. Н. П. Елаховская, К.П.Ершова и др. "К определению никеля в биологических материалах методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии", М. , Изд-во "Медицина", Гиг. и сан., 1978, с. 64-67.

3. Книга "Analytical methods for atomic absorption spectrometry". The Perkin Elmer Corporation, 1994, pp. 165.

4. Авт. свидетельство СССР 544915, кл. G 01 N 33/02, от 1975 г.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинским, токсикологическим исследованиям. Способ обеспечивает повышение точности определения, расширение спектра определяемых компонентов из одной пробы до шести при их совместном присутствии (марганец, свинец, никель, цинк, медь, хром) и уменьшение объема биоматериала для анализа. Обрабатывают исследуемую пробу кислотой, проводят последующее озоление ее, обработку полученной золы концентрированной минеральной кислотой, выпаривание до состояния влажных солей, введение фонового раствора и определение содержания металлов с помощью инструментального метода, при этом в качестве кислоты для обработки исследуемой пробы и в качестве фонового раствора используют 0,5-5,0%-ный водный раствор азотной кислоты при объемном соотношении проба : кислота, как 1:1, при этом перед озолением пробу подсушивают в два этапа при температуре 110^oС и 250^oС, озоление ведут при температуре 430^oС, в качестве концентрированной минеральной кислоты для обработки полученной золы используют концентрированную азотную кислоту, а в качестве инструментального метода используют атомно-абсорбционную спектрофотометрию. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ определения тяжелых металлов в цельной крови, включающий обработку исследуемой пробы кислотой, последующее озоление ее, обработку полученной золы концентрированной минеральной кислотой, выпаривание до состояния влажных солей, введение фонового раствора и определение содержания металлов с помощью инструментального метода, отличающийся тем, что в качестве кислоты для обработки исследуемой пробы и в качестве фонового раствора используют 0,5-5,0%-ный водный раствор азотной кислоты при объемном соотношении проба: кислота, как 1: 1, при этом перед озолением пробу подсушивают в два этапа при температуре 110 и 250^oС, озоление ведут при температуре 430^oС, в качестве концентрированной минеральной кислоты для обработки полученной золы используют концентрированную азотную кислоту, а в качестве инструментального метода используют атомно-абсорбционную спектрофотометрию. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время подсушивания пробы на каждом из этапов при температуре 110^oС и при температуре 250^oС составляет не менее 1,5 ч.