СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРОФОРМА И ТЕТРАХЛОРМЕТАНА В КРОВИ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/84 

Изобретение относится к области медицины, в частности к санитарным токсикологическим исследованиям, и может быть использовано при диагностике экологически обусловленной патологии, вызванной хлорорганическими соединениями, в лабораториях биохимии, специализированных учреждениях и клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений.

Известен микродиффузионный способ определения хлорированных углеводородов в различных биосубстратах (кровь, моча) в интервале 5-35 мг% (см., например, И.Д.Гадаскина и др. Превращение и определение промышленных органических ядов в организме, Л.: Медицина, 1971 г., с. 80-81).

Согласно этому способу по интенсивности окраски с помощью спектрофотометра производят количественное определение хлорированных углеводородов. Ошибка определения при этом составляет ± 5%.

Недостатком указанного известного способа является его недостаточная чувствительность.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по технической сущности является газохроматографический способ количественного определения хлороформа, тетрахлорметана и других хлорированных углеводородов в биологических материалах с использованием четырех колонок с жидкими фазами различной полярности (см., например, Мищихин В.А., Фелицын Ф.П. "Газохроматографическое обнаружение хлороформа, четыреххлористого углерода, дихлорэтана, трихлорэтана и хлоргидрата в биологическом материале", журнал "Судебно-медицинская экспертиза" - 1988 - N 2 - с. 30-33.

Газохроматографическое исследование в указанном известном способе осуществляют на газовых хроматографах ЛХМ-8МД и ЛХМ-80 с двумя пламенно-ионизационными детекторами. Анализ осуществляют на металлических колонках длиной 200 см, 300 см, 300 см и 300 см с внутренним диаметром 0,3 см, заполненных неподвижными жидкими фазами: 15% Сквалан на хроматоне N-AW, 15% 1,2,3-трис( β-цианэтокси) пропан на хроматоне N-AW, 15% ди-(2-этил-гексил)себацианат на динохроме II, 15% Карбовакс 20М на хезасорбе AW. Расходы газа-носителя (гелия) на всех колонках 30 см³/мин, воздуха 300 см³/мин, температура термостата колонок 90^oC, испарителя и детектора 170^oC.

Согласно этому способу пеницилиновый флакон с 5 граммами измельченного биологического материала (или 2 см³ жидкости) закрывают резиновой пробкой и фиксируют в металлический пенале. Затем цилиндр с флаконом нагревают на водяной бане при температуре 80^oC. По истечении 5 мин отбирают шприцем из флакона 2 см³ парофазной пробы и вводят ее в испаритель хроматографа. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

Недостатком указанного известного способа является его невысокая чувствительность по хлороформу, а именно 0,01 мг на 2 см³ крови (5 мкг/см³), и по тетрахлорметану (0,05 мг на 2 см³ крови, или 25 мкг/см³).

Кроме того, известный способ не обеспечивает достаточную точность определения как одного хлороформа, так и хлороформа и тетрахлорметана при их совместном присутствии, т. к. , например, при газохроматографическом установлении хлороформа указанным известным способом возникает необходимость его дифференцировать от хлоралгидрата, который способен привести к большим погрешностям при определении. С этой целью в известном способе сравнивают хроматограммы, полученные при исследовании биологического материала до и после добавления к нему во флакон щелочи. А вывод об обнаружении хлоралгидрата делают в случае появления на хроматограмме пика хлороформа или увеличения его высоты в 50-70 раз при исследовании материала после щелочного гидролиза хлоралгидрата. Все это делает определение известным способом недостаточно точным.

Целью настоящего изобретения является повышение чувствительности и точности определения хлороформа и тетрахлорметана в крови как при их совместном присутствии, так и в отдельности.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе количественного определения хлороформа и тетрахлорметана в крови путем извлечения указанных хлорированных углеводородов из пробы крови и последующего газохроматографического анализа, новым является то, что перед извлечением хлорированных углеводородов из пробы крови последнюю подщелачивают раствором щелочи до pH 8 - 10, извлечение хлорированных углеводородов производят путем экстракции их диэтиловым эфиром, а перед газохроматографическим анализом производят удаление белков из пробы крови.

При этом в качестве раствора щелочи используют 10%-ный раствор гидроксида натрия. А удаление белков из пробы производят путем центрифугирования.

Из патентной и научно-технической литературы нам не известны способы количественного определения хлороформа и тетрахлорметана в крови, содержащие совокупность предложенных нами признаков, что позволяет сделать вывод о новизне заявляемого технического решения.

Кроме того, из существующего уровня техники нам не известно, что существенные признаки, характеризующие предлагаемый способ, способны обеспечить повышение чувствительности и точности определения хлороформа и тетрахлорметана в крови как при их совместном присутствии, так и при определении по отдельности.

Экспериментальным путем обнаружено, что только применение в качестве экстрагента диэтилового эфира позволяет более полно извлечь хлороформ и тетрахлорметан из крови, и, как неожиданно оказалось, только при его использовании при pH 8 - 10 обеспечивается повышение чувствительности и точности определения. Зависимость степени экстракции хлороформа и тетрахлорметана из пробы крови от pH среды и природы различных органических растворителей приведена в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что наиболее эффективным экстрагентом для экстракции хлороформа и тетрахлорметана является диэтиловый эфир при pH 8 - 10, т.к. исследуемые компоненты хорошо растворимы в нем при этих условиях.

При осуществлении предлагаемого способа проводят следующие операции в нижеуказанной последовательности:
- берут пробу крови, содержащую хлороформ и тетрахлорметан;
- подщелачивают ее 10%-ным водным раствором гидроксида натрия до pH 8 - 10;
- затем в пробу крови добавляют диэтиловый эфир и смесь встряхивают в течение 1-2 минут для проведения экстракции хлороформа и тетрахлорметана;
- далее путем центрифугирования удаляют из пробы белки;
- полученный экстракт подвергают газохроматографическому анализу;
- количество хлороформа и тетрахлорметана определяют с использованием калибровочного графика.

Пример конкретного выполнения предлагаемого способа.

При осуществлении предлагаемого способа анализировали пробы крови у детей контрольной группы (проживающих в экологически благополучном районе) путем добавления в эти пробы различного количества хлороформа и тетрахлорметана. Пробы крови в объеме 1 см³, содержащие заданные концентрации хлороформа и тетрахлорметана, подщелачивали 10%-ным раствором гидроксида натрия до достижения pH 8 - 10 и экстрагировали 1 см³ диэтилового эфира в течение 1-2 минут. Далее пробу центрифугировали при 7000 об/мин в течение 2 минут для удаления белка. Полученный экстракт хроматографировали на хроматографе 3700 с детектором электронного захвата. Анализ осуществляли на стальной колонке 3 м х 3 мм, заполненной хроматоном N-AW-DMCS с нанесенной неподвижной жидкой фазой 15% Apiezon L. Режим работы прибора: температура термостата колонки 90^oC, температура испарителя 170^oC, температура детектора 250^oC, скорость газа-носителя (азот) 33 см³/мин. Затем, используя ранее построенные калибровочные графики, проводили количественное определение хлороформа и тетрахлорметана в крови.

Для построения калибровочных графиков использовали пробы крови, отобранные у контрольной группы детей и содержащие заданные концентрации хлороформа и тетрахлорметана. Определение проводили аналогично примеру 1 за исключением того, что при построении калибровочных графиков полученный экстракт - стандартный раствор каждой пробы, хроматографировали на хроматографе не менее 5 раз.

Данные о количественном определении хлороформа и тетрахлорметана предлагаемым способом приведены в таблице 2.

В результате проведенных лабораторных исследований было установлено, что чувствительность определения хлороформа в крови предлагаемым способом составляет 0,1 мкг/см³, а тетрахлорметана 0,018 мкг/см³ т.е. возможно определение хлороформа 0,0012 мкг, а тетрахлорметана 0,00018 мкг в анализируемом объеме пробы.

В ходе лабораторных испытаний также устанавливали точность (относительную погрешность) определения предлагаемым способом концентрации хлороформа и тетрахлорметана в крови при их совместном присутствии. Нормы точности измерений концентраций хлороформа и тетрахлорметана в пробе крови предлагаемым способом при n = 5 (пятикратном хроматографировании экстракта каждой пробы) и ρ = 0,95 (коэффициент корреляции), приведены в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что погрешность определения хлороформа предлагаемым способом составляет 21,67%, а тетрахлорметана 12,94%.

Таким образом, предлагаемым способом можно с высокой степенью точности и чувствительности определять хлороформ и тетрахлорметан в крови при их совместном присутствии в пробе.

Применение предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения как по хлороформу, так и по тетрахлорметану в 50 раз по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для токсикологических исследований при диагностике экологически обусловленной патологии, вызванной хлорорганическими соединениями, в лабораториях биохимии, специализированных учреждениях и клинико-диагностических лабораториях. Способ основан на извлечении хлороформа и тетрахлорметана из пробы крови и последующем газохроматографическом анализе при использовании метода абсолютной калибровки. Перед извлечением указанных хлорированных углеводородов из пробы крови последнюю подщелачивают раствором щелочи до рН 8-10. Извлечение хлорированных углеводородов производят путем экстракции их диэтиловым эфиром. Перед газохроматографическим анализом производят удаление белков из пробы крови, в качестве раствора щелочи возможно использовать 10%-ный раствор гидроксида натрия. Удаление белков ив пробы возможно осуществлять путем центрифугирования. Способ позволяет повысить чувствительность и точность определения хлороформа и тетрахлорметана в крови как при их совместном присутствии, так и в отдельности. 2 з.п. ф-лы. 3 табл.

1. Способ количественного определения хлороформа и тетрахлорметана в крови путем извлечения указанных хлорированных углеводородов из пробы крови и последующего газохроматографического анализа, отличающийся тем, что перед извлечением хлорированных углеводородов из пробы крови последнюю подщелачивают раствором щелочи до pH 8 - 10, извлечение хлорированных углеводородов производят путем экстракции их диэтиловым эфиром, а перед газохроматографическим анализом производят удаление белков из пробы крови. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве раствора щелочи используют 10%-ный раствор гидроксида натрия. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление белков из пробы производят путем центрифугирования.