СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФТАЛЕВОЙ КИСЛОТЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к исследованиям в области медицинской химии и может быть использовано для количественного определения фталевой кислоты - основного метаболита фталевого ангидрида - в сыворотке крови. Содержание фталевой кислоты в сыворотке крови может использоваться для исследования токсического воздействия фталевого ангидрида и как критерий состояния среды обитания.

Известен ряд способов определения фталевой кислоты в небиологических средах, таких как воздух (1) и природная вода (2). Указанные способы являются достаточно сложными.

Также известен способ анализа веществ в сыворотке крови путем хроматографирования анализируемой пробы на колонке, заполненной сорбентом с привитыми алкильными группами, с использованием в качестве экстрагента тройной смеси: спирт (метиловый, этиловый, изопропиловый):вода в соотношении (1-5):(5-1) и фосфорная кислота в количестве 0,001-0,002 моль/л (3). Однако указанным известным способом можно определять лишь суммарное количество исследуемых веществ в крови.

Известен способ определения суммы бензолкарбоновых кислот (бензойная и гиппуровая кислоты) в цельной крови (4). Принцип известного способа заключается в нитровании бензойной и гиппуровой кислот при комнатной температуре, восстановлении образующихся мононитрокислот до аминокислот, их диазотировании и связывании в окрашенный комплекс с нафтилэтилендиамином и фотометрировании окрашенного раствора. Чувствительность определения составляет 0,05 мг в 5 см³ крови или 10 мг/дм³. Недостатки указанного способа - длительность одного анализа более двух часов; низкая чувствительность; неспецифичность определения, не позволяющая проводить раздельное определение кислот. Помехами могут являться некоторые ароматические вещества, нитрирующиеся на холоде, например фенол, который встречается в крови.

Также известен способ раздельного определения бензолкарбоновых кислот (бензойной, салициловой и налидиксовой кислот) в сыворотке крови методом жидкостной хроматографии (5). Согласно указанному способу эстракцию кислот из биологического материала - сыворотки крови проводят с использованием сорбента Oasis HLB. Для этого конденсируют патрон с сорбентом 1 см³ метанола и 1 см³ дистиллированной воды, затем пропускают через патрон 1 см³ сыворотки, предварительно подкисленной 20 мм³ фосфорной кислоты, промывают сорбент 1 см³ 5%-ного водного раствора метанола и экстрагируют определяемые кислоты 1 см³ метанола. Экстракт высушивают в потоке азота при температуре 40°С и растворяют высушенный экстракт в 1 см³ раствора уксусной кислоты в подвижной фазе в концентрации 5 мкг/см³. Анализ экстракта проводят на жидкостном хроматографе на колонке Symmetra Shield™ RP₈, 5 мкм, 3 мм × 150 мм с Sentry™ - предколонкой. Подвижная фаза: 1,2%-ный раствор ледяной уксусной кислоты в соотношении с ацетонитрилом, равном 75:25 (по объему). Чувствительность определения составляет 0,1 мг/дм³.

Недостатком указанного известного способа является недостаточная точность определения при наличии в пробе биологического материала других бензолкарбоновых кислот, в частности при совместном присутствии фталевой и бензойной кислот. Кроме того, известный способ достаточно длителен.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в повышении точности определения фталевой кислоты в присутствии бензойной кислоты при одновременном сокращении времени определения.

Указанный технический результат обеспечивается предлагаемым способом определения фталевой кислоты в сыворотке крови, согласно которому берут пробу сыворотки крови, подкисляют ее водным раствором уксусной кислоты до рН, равного 3, осуществляют твердофазную экстракцию на сорбенте Oasis HLB с использованием для извлечения фталевой кислоты экстрагента - смеси метилового и изопропилового спиртов, взятых в объемном соотношении 9:1, затем полученный экстракт анализируют методом жидкостной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 15:85, предварительно подкисленную водным раствором ортофосфорной кислоты до рН, равного 3, а количество фталевой кислоты устанавливают по калибровочному графику.

В качестве водного раствора уксусной кислоты используют раствор 20%-ной концентрации.

В качестве водного раствора ортофосфорной кислоты используют раствор 0,2%-ной концентрации.

Экспериментальным путем обнаружено, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, при реализации которых и достигается высокая точность определения количества фталевой кислоты в сыворотке крови, в том числе в присутствии бензойной кислоты.

Для осуществления предлагаемого способа проводят следующие операции в нижеуказанной последовательности:

- берут 2 см³ пробы сыворотки крови, содержащей фталевую кислоту;

- подкисляют ее 0,05 см³ водного раствора уксусной кислоты до рН, равного 3, преимущественно 20%-ной концентрации;

- осуществляют твердофазную экстракцию на сорбенте Oasis HLB с использованием для извлечения фталевой кислоты экстрагента - смеси метилового и изопропилового спиртов, взятых в объемном соотношении 9:1;

- затем полученный экстракт анализируют методом жидкостной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 15:85, предварительно подкисленную 0,2%-ным водным раствором ортофосфорной кислоты до рН, равного 3;

- количество фталевой кислоты определяют с использованием калибровочного графика.

В лабораторных условиях был проведен ряд опытов для установления существенности признаков, положенных в основу предлагаемого способа.

Пример 1. Брали 2 см³ пробы сыворотки крови, содержащей фталевую кислоту. В эту пробу добавляли 0,05 см³ 20%-ного раствора уксусной кислоты до обеспечения рН, равного 3. Далее проводили твердофазную экстракцию на сорбенте Oasis HLB, для чего вначале очищали последний, пропуская через патрон с сорбентом 1 см³ метилового спирта и 1 см³ дистиллированной воды; затем пропускали 2 см³ сыворотки и 1 см³ 5%-ного водного раствора метилового спирта (для удаления из пробы сильнополярных соединений). Затем переносили патрон с сорбентом в бюкс и пропускали через сорбент экстрагент - 0,2 см³ смеси метилового и изопропилового спиртов в объемном соотношении 9:1. Далее 10 мкл полученного экстракта хроматографировали на хроматографе «Милихром-5-3» с ультрафиолетовым детектором. Анализ осуществляли на металлической колонке 80х2 мм, заполненной Диасорбом С₁₆. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 15:85, предварительно подкисленную 0,2%-ным водным раствором ортофосфорной кислоты до рН, равного 3. Режим работы прибора при этом был следующим: длина волны УФ-детектора 192 нм, скорость подвижной фазы 0,1 см³/мин. Затем, используя ранее построенный калибровочный график, проводили количественное определение фталевой кислоты в исследуемой пробе сыворотки крови.

Для построения калибровочного графика использовали пробы сыворотки крови, содержащие заданные концентрации фталевой кислоты. Определение проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что при построении калибровочного графика полученный экстракт - стандартный раствор каждой пробы хроматографировали на хроматографе 5 раз.

В результате проведенных, согласно примеру 1, лабораторных исследований было установлено, что чувствительность определения фталевой кислоты в сыворотке крови составляет 0,049 мкг в анализируемом объеме.

В ходе лабораторных испытаний экспериментально было установлено, что только применение в качестве экстрагента смеси метилового и изопропилового спиртов в соотношении 9:1 позволяет более полно извлечь фталевую кислоту с сорбента Oasis HLB, а добавление водного раствора уксусной кислоты (преимущественно 20%-ной концентрации) в анализируемую пробу сыворотки до установления рН, равного 3, позволяет также провести более полное извлечение фталевой кислоты из пробы и обеспечить более точное определение ее количества в пробе. Данные о степени экстракции фталевой кислоты из сыворотки и с сорбента Oasis HLB различными экстрагентами приведены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что оптимальный эффект (т.е. самая низкая погрешность определения) наблюдается при использовании в предлагаемом способе в качестве экстрагента смеси растворителей: метанола и изопропанола в соотношении 9:1, т.к. фталевая кислота хорошо растворяется в них, а в качестве подкислителя пробы - водного раствора уксусной кислоты, преимущественно, 20%-ной.

Для достижения высокой эффективности разделения (больше 1,0) фталевой и бензойной кислот и получения симметричных хроматографических пиков при хроматографировании полученного экстракта подвижную фазу подкисляли водным раствором ортофосфорной кислоты и проводили при этом определение при различных рН подвижной фазы. Зависимость эффективности разделения фталевой и бензойной кислот от рН и состава подвижной фазы приведена в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что только при использовании в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила и воды в объемном соотношении 15:85 и доведении кислотности смеси до рН, равного 3, обеспечивается наиболее высокая эффективность разделения фталевой и бензойной кислот. Снижение рН подвижной фазы ниже 3,0 приводит к нарушению структуры сорбента и, следовательно, к невозможности осуществления заявляемого способа.

В ходе лабораторных испытаний устанавливали точность (относительную погрешность) определения предлагаемым способом концентрации фталевой кислоты в сыворотке крови в присутствии бензойной кислоты. Результаты представлены в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что погрешность определения фталевой кислоты предлагаемым способом составляет 7,85%, что подтверждает высокую точность ее количественного определения при совместном присутствии с бензойной кислотой.

Вместе с этим, заявляемый способ позволяет сократить время определения по сравнению с известными аналогами в 1,5-2 раза.

Наряду с указанным, предлагаемый способ является относительно простым, что делает возможным его использование в широкой лабораторной практике.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Авт. свид. СССР №1483355, кл. G01N 30/02, опубл. 1989 г.

2. Авт. свид. СССР №873114, кл. G01N 31/00, опубл. 1981 г.

3. Авт. свид. СССР №1631416, кл. G01N 30/22, опубл. 1991 г.

4. Гадаскина И.Д., Фидов В.А. Превращения и определение промышленных органических ядов в организме. Л., Медицина, 1971, с.52-55.

5. Pharmaceutical Applications Notebook, 2002, Waters Corporation. Rev 4, 10/02.

Таблица 1Данные о степени экстракции фталевой кислоты из сыворотки крови различными экстрагентамиЭкстрагентПодкислитель пробы сыворотки кровиУстановленное в процессе количество фталевой кислоты, мкг/см³Погрешность определения, %МетанолОртофосфорная кислота (20 мкл)0,79±10,4Уксусная кислота (50 мкл)0,81±12,3Соляная кислота (20 мкл)0,70±15,8ЭтанолОртофосфорная кислота (20 мкл)0,64±16,4Уксусная кислота (50 мкл)0,67±16,3Соляная кислота (20 мкл)0,44±15,9Метанол:изопропанол (90:10)Ортофосфорная кислота (20 мкл)1,05±6,8Уксусная кислота (50 мкл)1,36±6,4Соляная кислота (20 мкл)0,78±8,7

Таблица 2Зависимость эффективности разделения фталевой и бензойной кислот от рН и состава подвижной фазыСостав подвижной фазырН подвижной фазыЭффективность разделения кислотФталевойБензойнойВода:ацетонитрил = 85:15 + Ортофосфорная к-та5,00,180,78То же4,00,300,94То же3,01,604,00То же2,6--Вода:ацетонитрил = 80:20 + Ортофосфорная к-та3,00,933,310,01 М фосфатного буферного раствора с добавлением 30 об.% метанола3,00,973,19

Таблица 3Данные о точности измерения концентрации фталевой кислоты в сыворотке крови предлагаемым способомОпределяемое веществоКонцентрация определяемого веществаДоверительный интервал определения, мкг/см³Среднее квадратичное отклонениеВероятная относительная погрешность, %заданополученоminmaxФталевая кислота0,0490,049250,04170,05140,0005247,850,050250,048750,05050,050

Настоящее изобретение относится к диагностическим методам. Предложенный способ количественного определения фталевой кислоты заключается в том, что берут 2 см³ пробы сыворотки крови, содержащей фталевую кислоту; подкисляют ее водным раствором уксусной кислоты до рН, равного 3; осуществляют твердофазную экстракцию на сорбенте Oasis HLB с использованием для извлечения фталевой кислоты экстрагента - смеси метилового и изопропилового спиртов, взятых в объемном соотношении 9:1. Затем полученный экстракт анализируют методом жидкостной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 15:85, предварительно подкисленную водным раствором ортофосфорной кислоты до рН, равного 3. Количество фталевой кислоты определяют с использованием калибровочного графика. Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в повышении точности определения фталевой кислоты в присутствии бензойной кислоты при одновременном сокращении времени определения. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ количественного определения фталевой кислоты в сыворотке крови, характеризующийся тем, что берут пробу сыворотки крови, подкисляют ее водным раствором уксусной кислоты до рН равного 3, осуществляют твердофазную экстракцию на сорбенте Oasis HLB с использованием для извлечения фталевой кислоты экстрагента - смеси метилового и изопропилового спирта, взятых в объемном соотношении 9:1, затем полученный экстракт анализируют методом жидкостной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрила и воды в объемном соотношении 15:85, предварительно подкисленную водным раствором ортофосфорной кислоты до рН равного 3, а количество фталевой кислоты устанавливают по калибровочному графику.2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве водного раствора уксусной кислоты используют раствор 20%-ной концентрации.3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве водного раствора ортофосфорной кислоты используют раствор 0,2%-ной концентрации.