СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОПЕРОКСИДАЗНЫХ КОНЪЮГАТОВ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/395 A61K39/00 G01N33/531 

Изобретение относится к биотехнологии и может широко применяться в медицине и ветеринарии при проведении иммуноферментного анализа для индикации и идентификации в сыворотке крови кур антител различного происхождения.

Известен способ (прототип) изготовления антивидовых иммунопероксидазных конъюгатов, одной из стадий которого является выделение желточных антител с помощью двукратного переосаждения полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000) (12% вес/объем) при центрифугировании в течение 10 мин при 14000 об/мин на центрифуге К-24 с последующей доочисткой препарата IgG гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-200 [Ярыгина Е.И., Быкова Н.Н. "Применение аффинной хроматографии для получения иммунопероксидазного конъюгата анти-IgG кур" - Тезисы докладов научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня основания Курской биофабрики, положившей начало развитию агробиологической промышленности в России (1986-1996), Курск, 1996, стр. 369-370]. Однако этот способ имеет следующие недостатки: стадия доочистки очень трудоемка и дорогостояща, к тому же требуется проводить концентрирование IgG, сошедшего с колонки. Другим недостатком прототипа является то, что определение количества анти-IgG антител в гипериммунной антисыворотке проводится по результатам титрования в реакции диффузионной преципитации (РДП), что не гарантирует получение высокоактивного и специфичного конъюгата, так как сыворотки, полученные на IgG желтка яиц кур, обладая преципитирующей активностью, не обязательно высокоспецифичны в иммуноферментном анализе (ИФА) при взаимодействии с гомологичными антигенами.

Целью заявляемого изобретения является повышение активности и специфичности целевого продукта, а также снижение себестоимости препарата. Указанная цель достигается тем, что иммунохимически чистые IgG желтка яиц кур получают пятикратной преципитацией полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000 Д (ПЭГ-6000), а анти-IgG кур антитела в гипериммунной сыворотке определяют титрованием в иммуноферментном анализе с гомологичными антигенами. Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. На первом этапе проводят выделение и очистку иммуноглобулинов класса G (IgG) из желтка яиц кур. Известны способы выделения IgG из желтка яиц кур. Однако эти способы характеризуются рядом недостатков: 1) хроматография - трудоемкостью и большими временными затратами [Afraz F. Yamamoto Y., Okadea I. Devergent selection for delayedtype wattle reaction of domestic fowls to BCG antigen. // Britesh Poultry Sci. -1994. - V.36, 1. - 47-58]; 2) наличием примесных белков - осаждение этанолом [Моntoya A., Castell J.V. Long-term storage of peroxidase-labeled immunoglobulins foruse in enzyme immunoassay. // J. Immunol. Meth. - 1988. - V. 110. - P. 13-20]; 3) высаливание сульфатом аммония [Скобина З.В., Джавадов Э.Д., Кудрявцева Ф.С. Получение специфических компонентов для выделения вируса гриппа птиц в иммуноферментном анализе. // Сб. науч. трудов "Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями сельскохозяйственных птиц", ч. 1. - 1988. - С. 44-50] ; 4) полиэтиленгликолем [Polson A., Barbara М. von Wechmar., Farakertey G. Antibodies to protein from yolk of immunize Hens. // Immunological Communications. - 1980. - V.9. - 5. - P. 495-514]; 5) высокой себестоимостью конечного продукта [Hassl A., Horst A. Purification of egg yolk immunoglobulins. A twostep procedure using hydrophobic interaction chromatography and gel filtration. // J. Immunol. Meth. - 1988. - V.110, 2. - Р. 225-228.]
По заявляемому способу γ-глобулиновую фракцию, состоящую в основном из IgG желтка, отделяют от липидов и пигментов путем осаждения их ПЭГ-6000 в концентрации 3,5% (вес/объем). Затем γ-глобулиновую фракцию, содержащуюся в супернатанте, подвергают пятикратному переосаждению ПЭГ-6000 с концентрацией 12% (вес/объем) без последующей доочистки на колонке с сефадексом G-200. Полученный таким образом препарат IgG не содержит примесей, а по активности не уступает препарату, полученному по способу-прототипу, одной из стадий которого является обязательная доочистка препарата после двукратного переосаждения ПЭГ-6000 на колонке с сефадексом G-200. Сравнительные данные активности и чистоты препарата IgG представлены в табл. 1.

Пример 2. Препарат IgG используют при гипериммунизации животных, например кроликов, баранов, морских свинок и др. для получения сыворотки, содержащей анти-IgG кур антитела.

При использовании препарата IgG, полученного по заявляемому способу, достаточно одной ревакцинации для получения высокоактивных и специфичных сывороток, в то время как при использовании препаратов IgG, содержащих примесные белки (полученные известным способом) требуется не менее 3-5 ревакцинаций.

Обычно для определения титров анти-IgG антител применяют РДП [Roberts D. H. , Lucas M.H., Swallow С. Comparison of the agar gel immunodiffusion test and ELISA in the detection of bovine leukosis virus antibody in cettle persistently infected with bovine virus diarea virus. //Vet. Immunol. Immunopatj. - 1989. - V.22. - P. 275-281]. Однако в зависимости от индивидуальных особенностей иммунной системы животного-донора анти-IgG антител могут образовываться антитела, обладающие различной степенью активности и специфичности [Эффективность различных адъювантов при получении диагностических сывороток. /В. А. Мищенко, А. И. Дудников, М. А. Базаров и др. - Сб. науч. трудов "Вирусные и микробные болезни животных". - Владимир, 1995. - С.149-152]. По заявляемому способу во избежание получения неактивного и низкоспецифичного пероксидазного конъюгата активность и специфичность анти-IgG антител в гипериммунной сыворотке определяют титрованием в иммуноферментном анализе (ИФА) с гомологичными антигенами. Сравнительные данные титрования анти-IgG антител в РДП и в ИФА представлены в табл. 2.

Из таблицы 2 следует, что гипериммунные антисыворотки, одинаково активные в РДЦ, обладают не одинаковой активностью в ИФА.

Пример 3. Для конъюгации перйодатным методом аффинно очищенных антивидовых антител с пероксидазой хрена (RZ=3) используют анти-IgG кур антитела по результатам титрования в ИФА. Сравнительные данные активности и специфичности конъюгатов, изготовленных по способу-прототипу и заявляемому способу, приведены в таблице 3.

Таким образом, заявляемый способ изготовления иммунопероксидазных конъюгатов позволяет повысить активность и специфичность препарата и значительно снизить его себестоимость.

Изобретение относится к биотехнологии. Выделение иммуноглобулинов класса G проводят пятикратным переосаждением полиэтиленгликолем-6000. Иммунизируют животных выделенными иммуноглобулинами класса G для получения антивидовой сыворотки. Выделяют специфические антитела из антивидовой сыворотки и определяют их активность и специфичность путем титрования в иммуноферментном анализе с гомологичными антигенами. Способ позволяет повысить активность и специфичность целевого продукта. 3 табл.

Способ изготовления иммунопероксидазных конъюгатов, включающий выделение иммуноглобулинов класса G из желтка яиц кур путем осаждения их полиэтиленгликолем-6000, иммунизацию животных выделенными иммуноглобулинами класса G для получения антивидовой сыворотки, выделение специфических антител из антивидовой сыворотки и конъюгацию специфических антител с пероксидазой, отличающийся тем, что выделение иммуноглобулинов класса G проводят пятикратным переосаждением полиэтиленгликолем-6000, а после выделения специфических антител из антивидовой сыворотки определяют их активность и специфичность путем титрования в иммуноферментном анализе с гомологичными антигенами.