СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛЕПТОСПИР Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии, микробиологической промышленности, биотехнологии, а именно к способам приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов семейства лептоспир, и может быть использовано при их промышленном и лабораторном культивировании с целью приготовления вакцин для профилактики лептоспироза у сельскохозяйственных животных и людей, а также приготовления антигенов для постановки диагностической реакции микроагглютинации.

Известны способы изготовления ростовых питательных сред на основе ферментативных гидролизатов мышц, лактоальбумина и других, заключающиеся в том, что к сбалансированным солевым растворам добавляют соответствующее количество указанных белковых гидролизатов и используют их при культивировании культур клеток вне организма животных.

Недостатком этих способов является то, что они ограничены использованием таких питательных сред только для клеточных культур, используемых затем для выращивания, или репродукции, в них различных вирусов (см. Е.Г. Панкова. Гидролизат мышечных белков как источник питания при культивировании клеток in vitro. - Ветеринария, 1976. - 1. - c.98-100; В.А. Сергеев. Репродукция и выращивание вирусов животных. - М.: Колос, 1976. - с.45-60; Гидролизат мышечных белков сухой (ФГМ-с) для питательных сред тканевых культур. Технические условия ТУ 46.12,20-80, утверждены Главветупром МСХ СССР 23.07.1980; Л. П. Дьяконов, В.Ф. Глухов, А.А. Поздняков и др. Культивирование клеток и тканей животных. - Ставрополь, 1986. - c.17; Н.Д. Скичко, Л.Г. Перельштейн, В. В. Желтов. Использование сухого ферментативного мышечного гидролизата для культивирования вируса герпеса индеек. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. Экспресс-информация, Вып.1, - М.: 1986. - С.1-4; И.К. Тутов, В.И. Ситьков. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. - Ставрополь, 1997. - С.35-39).

Известны способы получения питательных сред для различных микроорганизмов из гидролизатов рыбы и говядины, из гидролизатов казеина и дрожжей, из гидролизатов глобулинов, куриных эмбрионов, фибрина, сгустков крови и т. д., заключающиеся в том, что гидролизаты добавляют к деминерализованной воде в таких количествах, чтобы в питательной среде содержалось не менее 160-180 мг% аминного азота.

Недостатком этих способов является то, что они ограничены использованием указанных гидролизатов для приготовления питательных сред для культивирования истинных бактерий и микоплазм (см. В.И. Бобрышев. Изыскание питательных сред для культивирования птичьих микоплазм в лабораторных и производственных условиях. Автореферат дисс. канд. вет. наук. - Ставрополь, 1973. - 20 с; Н. П. Власов, А.А. Маслак, Н.И. Емельянов, А.С. Фоменко. Исследование по оптимизации состава питательной среды на основе ФКДГ для культивирования бактерий рожи свиней. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. Экспресс-информация. Вып.11. - М., 1984. - С.7-10; А.Д. Гудинова, Б. Г. Лавченко и др. Использование продукта микробиологического синтеза для получения гидролизатов. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. Экспресс-информация. Вып.5. - М., 1985. - С. 4-7; В. И. Ситьков, В.И. Заерко, А.П. Сурмило, И.К. Тутов, Р.Г. Колпакова. Способ получения гидролизатов и использование их при изготовлении питательных сред для культивирования микроорганизмов. Патент 2103345 от 27.01.1998 г.).

Наиболее близким к предлагаемому способу и принятым за прототип является способ изготовления питательной среды ГНКИ для культивирования патогенных лептоспир, заключающийся в добавлении к основе питательной среды в виде фосфатно-буферного раствора альбуминовой фракции сыворотки крови овец (см. Методика изготовления питательной среды ГНКИ для культивирования патогенных лептоспир. Утверждена Главветупром МСХ СССР 02.11.1964; А.С. Фоменко. Использование питательной среды ГНКИ-1 для изготовления вакцины против лептоспироза. Тр. Ставропольского СХИ. - Вып.24. - Ставрополь, 1967. - с.329-332; А.С. Фоменко. Культивирование патогенных лептоспир в питательной среде ГНКИ с целью промышленного изготовления вакцины. Автореферат дисс. канд. вет. наук. - Ставрополь, 1969.-c.6-9).

Недостатком этого способа является то, что получение альбумина из сыворотки крови связано с необходимостью содержания на биопредприятиях, производящих вакцину против лептоспироза, большого количества овец-продуцентов для получения от них крови, отделением из крови сыворотки, высаливанием из нее и удалением глобулиновой фракции, высаливанием альбумина, его диализом, фильтрацией, расфасовкой, хранением, проверкой на стерильность, отделением белка и т.д. Эти мероприятия весьма дорогостоящие.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении предлагаемого изобретения, сводится к изысканию экономичной и достаточно эффективной питательной среды для культивирования лептоспир с добавлением ферментативного гидролизата мышц (ФГМ).

Технический результат достигается тем, что в предложеном способе приготовления питательной среды, включающем культивирование лептоспир в водно-сывороточной среде с применением фактора роста, в качестве фактора роста лептоспир к водно-сывороточной основе питательной среды добавляют ферментативный гидролизат мышц в количестве 0,2-0,25% к общему объему среды с последующей стерилизующей фильтрацией. Питательная среда для культивирования лептоспир на водно-сывороточной основе с добавлением ферментативного гидролизата мышц должна сдержать при значении рН 7,4-7,6 следующее соотношение химических соединений, мас.%:
Хлорид натрия - 0,05-0,1
Белок - 0,22-0,28
Зольные элементы - 0,02-0,03
а также, мг%:
Общий азот - 42-46
Аминный азот - 7-13
Для реализации поставленной цели была поставлена задача - в питательной среде для культивирования лептоспир заменить дорогостоящий альбумин на равноценное в биологическом смысле или более обогащенное белоксодержащее вещество другого происхождения. Для этого вместо 0,1% альбумина, из расчета на сухое вещество, к водно-сывороточной среде для культивирования лептоспир добавляли гидролизат лактоальбумина (ГЛА), гидролизат белков сыворотки молока (ГСБМ), ферментативный гидролизат мышц (ФГМ), применяемые в биологической промышленности для культивирования других микроорганизмов и тканевых клеток.

Опыты по культивированию лептоспир в эксперементальных средах проводили по принятым в биопромышленности технологическим условиям. ГЛА, ГСБМ и ФГМ испытывались в концентрациях от 0,1 до 0,3% к общему объему среды. Первоначально опыты по культивированию лептоспир в опытных и контрольных средах проводили в 0,2- и 0,5-литровых флаконах. Затем исследования проводились в производственных условиях, лептоспиры культивировали в опытных и контрольных средах в 16-литровых бутылях.

При учете результатов опытов проводилось изучение морфологии лептоспир, их накопление, активность движения по общепринятым показателям для этой группы микроорганизмов.

Сущность способа заключается в следующем. Для приготовления опытных вариантов питательных сред для культивирования лептоспир к водно-сывороточной основе добавляют по 0,1-0,3% ферментативных гидролизатов мышц (ФГМ), гидролизата лактоальбумина (ГЛА), гидролизата сывороточных белков молока (ГСБМ). Контрольной средой служит применяемая производственная водно-сывороточная среда с 0,1% альбумина. Культивирование лептоспир производилось согласно существующим инструкциям при температуре 28-30^oС в течение 5-7 суток. В опытах по культивированию использовали производственные штаммы лептоспир серологических групп: Гриппотифоза, Помона, Тарассови, Иктерогеморрагия, Каникола, Сейро. После окончания сроков культивирования оценку опытов осуществляют методом микроскопии мазков - "раздавленная капля" в темном поле зрения микроскопа. При этом о накоплении лептоспир судят по их количеству в поле зрения, морфологию и активность лептоспир учитывают согласно инструкции по четырехбалльной системе.

Конкретное выполнение способа приготовления питательной среды для культивирования лептоспир на основе ферментативного гидролизата мышц отражено в следующих примерах.

Пример 1. Опыты проводили, выращивая лептоспиры различных серологических групп в 200 см³ флаконах со 100 см³ водно-сывороточной среды с добавлением альбумина (контроль), ферментативного гидролизата мышц (ФГМ), нативного гидролизата лактоальбумина (ГЛА), гидролизата сывороточных белков молока (ГСБМ). Культивирование лептоспир серогрупп Гриппотифоза, Помона, Тарассови, Иктерогеморрагия, Каникола и Сейро проводили согласно действующей инструкции в питательных средах с рН 7,2-7,4 при 28-30^oС в течение 5-7 суток. Накопление количества лептоспир определяли методом темнопольной микроскопии. Средние результаты пятикратных исследований представлены в таблице 1.

Данные таблицы 1 свидетельствуют, что по сравнению с контрольной средой накопление лептоспир по всем серогруппам в опытных вариантах было значительно ниже, так как в опытных питательных средах содержание белка составляло по 0,1-0,11%, что на 50% ниже, чем в контрольной среде.

Пример 2. С учетом первого примера факторы роста (ФГМ, ГЛА, ГСБМ) добавляли по 0,2% к водно-сывороточной среде. В контрольной среде содержание альбумина соответствовало требованиям производственной методики и составляло 0,1%.

Средние результаты представлены в таблице 2.

Данные таблицы 2 свидетельстуют, что добавление в качестве факторов роста ФГМ, ГЛА, ГСБМ в количестве 0,2% к водно-сывороточной среде обеспечивает равнозначное накопление лептоспир, т.е. до уровня показателей контроля.

Пример 3. Были проведены опыты по добавлению к водно-сывороточной среде по 0,25% ФГМ, ГЛА и ГСБМ. В контрольной среде содержание альбумина составляло 0,1%. Средние показатели представлены в таблице 3.

Данные таблицы 3 свидетельствуют, что опытные варианты питательных сред для культивирования лептоспир равнозначны контролю. Содержание в них белка составляет 0,25% и соответствует технологическим условиям. Во всех опытах отмечено, что в испытуемых средах лептоспиры по накоплению, морфологическим свойствам, активности движения соответствуют технологическим требованиям. Из всех факторов роста наиболее экономически выгодным оказался ферментативный гидролизат мышц, так как его затраты на 1000 литров питательной среды в 27 раз ниже, чем затраты по использованию альбумина. Он более технологичен и в 12 раз дешевле, чем ГЛА и ГСБМ.

В опытах по повышению концентрации ФГМ в питательной среде установлено, что 0,3% его содержания в среде ингибирует рост лептоспир, а именно накопление лептоспир было на 20-60% меньше, чем в контрольной среде. Поэтому такую концентрацию ФГМ использовать для культивирования лептоспир не целесообразно.

Пример 4. Полученные результаты по использованию ФГМ как фактора роста лептоспир при выращивании их на водно-сывороточной среде позволили провести производственные испытания по выращиванию лептоспир в средах с 0,2-0,25% указанного фактора роста в сравнении со средами с альбумином (контроль). Всего испытано 11 производственных серий водно-сывороточной среды с содержанием 0,1% альбумина к объему водно-сывороточной основы. В опытные и контрольные среды в соответствии с действующей инструкцией добавляли витамины B₁, B₁₂ пo 5 и 0,2 мкг на 1 л среды.

Средние результаты производственных опытов представлены в таблице 4.

Данные производственных опытов показывают, что накопление лептоспир серогрупп Гриппотифоза, Тарассови, Икерогеморрагия, Каникола и Сейро на среде с ФГМ было выше на 10-15%, чем в альбуминовой среде.

Кроме поисков наиболее оптимальных концентраций ФГМ для замены ими дорогостоящего альбумина в питательной среде для лептоспир в каждом опыте изучался биохимический состав среды. При этом установлено, что биохимический состав контрольных сред был одинаковым и стабильным. Питательная среда для культивирования лептоспир на водно-сывороточной основе с добавлением ферментативного гидролизата мышц при значении рН 7,4-7,6 имела следующее соотношение химических соединений, мас.%:
Хлорид натрия - 0,05-0,1
Белок - 0,22-0,28
Зольные элементы - 0,02-0,03
а также, мг%:
Общий азот - 42-46
Аминный азот - 7-13
Таким образом, замена в питательной среде для культивирования лептоспир альбумина на ферментативный гидролизат мышц позволяет значительно снизить себестоимость питательной среды и облегчить труд работников биопредприятий, занимающихся производством биопрепаратов для профилактики лептоспироза у животных.

По сравнению с прототипом и известными техническими решениями предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества:
- при изготовлении питательной среды для культивирования патогенных лептоспир используется более дешевое, чем альбумин, белоксодержащее сырье - нативный ферментативный гидролизат мышц;
- процесс приготовления ФГМ более технологичен по сравнению с приготовлением альбумина, ГЛА и ГСБМ;
- значительно облегчает труд работников биопредприятий, занимающихся производством биопрепаратов против лептоспироза животных.

Изобретение относится к микробиологии, микробиологической промышленности, биотехнологии, а именно к способам приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов семейства лептоспир, и может быть использовано при их промышленном и лабораторном культивировании с целью приготовления вакцин для профилактики лептоспироза сельскохозяйственных животных и людей. Культивирование лептоспир ведут в водно-сывороточной среде, содержащей ферментативный гидролизат мышц (ФГМ) в заданном количестве химических соединений при рН 7,4-7,6. Культивирование лептоспир производят согласно существующим инструкциям при температуре 28-30^oС в течение 5-7 суток. В опытах по культивированию используют производственные штаммы лептоспир серологических групп: Гриппотифоза, Помона, Тарассови, Интерогеморрагия, Каникола, Сейро. Изобретение повышает эффективность и экономичность среды. 4 табл.

Способ культивирования лептоспир на модифицированной фактором роста водно-сывороточной среде, отличающийся тем, что в качестве фактора роста лептоспир в среду добавляют ферментативный гидролизат мышц в количестве, обеспечивающем содержание в ней следующих химических соединений при значении рН 7,4-7,6 мас.%:
Хлорид натрия - 0,05 - 0,1
Белок - 0,22 - 0,28
Зольных элементов - 0,02 - 0,03
а также, мг%
Общий азот - 42 - 46
Аминный азот - 7 - 13а