СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЛЕПТОСПИРОЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/02 C12N1/02 C12N1/04 A61K39/02 A61K39/00 A61K39/116 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и может быть использовано в биологической промышленности при изготовлении вакцин для профилактики лептоспироза.

Известен способ получения поливалентной вакцины ВГНКИ против лептоспироза животных, включающий культивирование производственных штаммов лептоспир соответствующих серологических групп в сывороточной среде, консервацию лептоспир, обработку трихлоруксусной кислотой для осаждения белка среды и лепроспир,нейтрализацию осажденной массы и добавление гидроокиси алюминия [1]
Однако известный способ нетехнологичен,для концентрирования лептоспир используется вредное химическое вещество трихлоруксусная кислота (ТХУ), получаемая известным способом вакцина содержит большое количество балластных неспецифических антигенов.

Наиболее близким аналогом является способ получения поливалентной вакцины против лептоспироза животных, включающий выращивание производственных штаммов лептоспир в сывороточной среде, осаждение лептоспир трихлоруксусной кислотой, отстаивание, декантирование надосадочной жидкости, концентрирование осадка центрифугированием, нейтрализацию кислоты в осадке раствором аммиака, добавление к нейтрализованному центрифугату дистиллированной воды из расчета, чтобы осадок был сгущен в 25-30 раз по сравнению с исходной культурой и соединение с адъювантом гидроокисью алюминия в количестве 32-35% [2]
Недостатком известного способа является сложная многоэтапная технология изготовления, предусматривающая использование вредных химических веществ, изготавливаемая вакцина недостаточно иммуногенна и вследствие большой плотности вызывает трудности при введении ее животным.

Кроме того, известным способом получают вакцину в жидкой форме, требующую для расфасовки большого количества стеклотары, на ее хранение и транспортировку расходуется много средств.

Технической задачей изобретения является разработка технологичного способа изготовления вакцины против лептоспироза, обладающей высокой иммуногенностью, стандартностью, низкой реактогенностью и удобной в транспортировке и хранении.

Технический результат изобретения заключается в получении поливалентной вакцины против лептоспироза животных с повышенной иммуногенностью, стандартной, низкой реактогенностью, в лиофилизированной форме, удобной для хранения и транспортировки.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Способ получения поливалентной вакцины против лептоспироза животных, включающий стадии: подбор производственных штаммов лептоспир по серогрупповому составу, приготовление питательной среды на основе сыворотки крови, ее стерилизацию, культивирование штаммов лептоспир,инактивацию и концентрирование бактериальной массы,внесение адъюванта и повторную инактивацию мертиолятом, отличается тем, что стерилизацию питательной среды проводят микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,2-0,28 мкн, инактивацию культур лептоспир осуществляют 0,1-0,3%-ным раствором формалина, бактериальную массу концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах в тангенциальном потоке со скоростью 6,0-10,0 л/ч•м², адъювант гидроокись алюминия добавляют в конечной концентрации 20-25 об. в полученную смесь вносят защитную среду высушивания, содержащую, мас. сахароза 14-26; желатина 2-6, пептон 0,5-2, фосфатный буфер остальное, и после инактивации мертиолятом подвергают замораживанию до (-45)-(-50)^oС в течение 12-14 ч, а затем высушиванию до ост. влажности 1-4%
В отличие от известного способа в результате микрофильтрационной стерилизации и очистки питательной среды снижается гетерогенность среды, из нее удаляются высокомолекулярные ингибиторы и сохраняются ростовые факторы, что значительно улучшает ее качество и позволяет получить полноценную в антигенном отношении культуру лептоспир с большим выходом и высокой иммуногенностью.

В процессе изготовления вакцины не происходит снижение иммуногенной и антигенной активности лептоспир благодаря также мягкому режиму инактивации и концентрированию бакмассы ультрафильтрацией на полых волокнах.

Согласно изобретению к концентрированным культурам лептоспир добавляют 6% -ный раствор геля гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20-25% к объему вакцины. Добавка к сырью менее 20% ГОА является недостаточной для полной адсорбции лептоспир, что снижает качество вакцины. Добавление к сырью более 25% ГОА на качество вакцины не влияет, но экономически нецелесообразно.

Оптимальной защитной средой высушивания для сохранения ГОА в состоянии геля после лиофильной сушки и последующего ресуспендирования является сахарозо-желатиново-пептонная среда, приготовленная на фосфатном буфере в указанном соотношении.

Изобретение позволяет получить поливалентную вакцину в лиофилизированной форме.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для приготовления поливалентной вакцины используют производственные штаммы лептоспир различных серологических групп: Гриппотифоза (ВГНКИ-1), Иктерогеморрагия (ВГНКИ-2), Тарассови (ВГНКИ-4), Помона (ВГНКИ-6), Сейро (Харджио), Каникола (ВГНКИ-3), которые поддерживают путем регулярных пересевов и пассажей и осуществляют постоянный контроль по морфологии, культуральным и антигенным свойствам.

Для культивирования лептоспир готовят питательную среду на основе сыворотки крови следующего состава:
фосфатный буфер с рН 7,2-7,4 93-95% и инактивированная сыворотка крови овец 5-7% или
фосфатный буфер с рН 7,2-7,4 93-94% инактивированная сыворотка крови овец 5-6% альбуминовая фракция сыворотки крови овец с фактором роста 1%
Приготовленную среду подвергают стерилизации микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,22 мкн.

Производственные штаммы и матровые расплодки лептоспир культивируют только в сывороточной среде, приготовленной по первому варианту, а сывороточно-альбуминовую среду используют только для однократного получения производственной расплодки.

Культивирование лептоспир проводят при 27-28^oС без доступа света в течение 5-7 сут до накопления лептоспир не менее 60 млн микробных клеток в 1 см³. В процессе культивирования культуры лептоспир проверяют на чистоту роста.

Чистые культуры лептоспир используют для составления серии вакцины. При этом готовят вакцину в трех вариантах. При составлении серии первого варианта отбирают в равных соотношениях культуры лептоспир трех серогрупп: Иктерогеморрагия (ВГНКИ-2), Тарассови (ВГНКИ-4) и Помона (ВГНКИ-6). При составлении серии вакцины второго варианта отбирают в равных соотношениях культуры лептоспир четырех серогрупп: Гриппотифоза (ВГНКИ-1), Тарассови (ВГНКИ-4), Помона (ВГНКИ-6), Сейро (Харджио). При составлении серии вакцины третьего варианта отбирают в равных соотношениях лептоспиры двух серогрупп: Иктерогеморрагия (ВГНКИ-2) и Каникола (ВГНКИ-3).

После составления серии вакцины лептоспиры инактивируют 0,2%-ным раствором формалина и выдерживают в течение 12 ч при 37^oС.

Концентрирование инактивированной формалином культуры лептоспир проводят на установке УПВ-6 и модуле МСМ-1,5, принцип работы которых основан на разделении растворов высокомолекулярных веществ ультрафильтрацией на полых волокнах в тангенциальном потоке со скоростью 7 л/ч•м². При этом добиваются концентрирования культур лептоспир в 20-30 раз, что определяется по объему отфильтрованной жидкости и подсчетом количества лептоспир при темнопольной микроскопии.

Затем к концентрированной и инактивированной культуре лептоспир добавляют простерилизованный 6%-ный раствор ГОА в количестве 20% к объему вакцины, смесь энергично перемешивают или пропускают через коллоидную мельницу, после чего к смеси биомассы лептоспир и ГОА добавляют защитную среду высушивания до десятикратной концентрации культуры. В качестве защитной среды высушивания используют среду, содержащую, cахароза 20, желатин 4, пептон 1 и фосфатный буфер 75.

Для надежности стерилизации к полученной смеси добавляют раствор мертиолята из расчета 1 г на 10 л вакцины, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч, после чего проверяют на стерильность.

Для получения сухой вакцины инактивированную концентрированную биомассу лептоспир с защитной средой высушивания расфасовывают в асептических условиях в стерильные флаконы, установленные в кассеты. Кассеты помещают в низкотемпературный шкаф, где проводят заморозку до -45^oС и выдерживают в этих условиях 13 ч. Затем кассеты погружают в сублимационную установку с предварительно охлажденным конденсатором до -60^oС Сублиматор герметизируют и камера вакуумируется. Через 2 ч после вакуумирования камеры включают подогрев полок. Конечная температура полок 30^oС достигается в течение 5 ч и поддерживается автоматически в данном режиме до конца сушки. Время сублимации 30 ч. Далее подогрев на полках снижают и производят досушивание в течение 24 ч. Остаточная влажность массы во флаконах должна быть 1-4% Общее время сушки 76 ч.

Каждую серию вакцины контролируют на внешний вид, растворимость, влажность, стерильность, безвредность и активность по общепринятым методикам.

Пример 2. При проверке полученных по примеру 1 серий вакцины установлено следующее.

Вакцины обладают хорошей растворимостью; безвредны; стерильны; высоко активны: титр антител составляет 1:1600 1:3200 к лептоспирам серологических групп Помона, Иктерогеморрагия, Тарассови и 1:400 1:1600 к лептоспира серогруппы Каникола.

Использование: биотехнология, микробиология, вакцина для профилактики лептоспироза. Сущность изобретения заключается в следующем: отбирают штамм лептоспир серогрупп Интерогеморрагия, Тарасови, Помона или серогрупп Гриппотифоза, Тарасови, Помона, Сейро или серогрупп Иктерогеморрагия и Каникола. Для культивирования лептоспир используют питательные среды на основе сыворотки крови, которые стерилизуют микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,2-0,28 мкн. Выросшие культуры инактивируют 0,1-0,3%-ным раствором формалина,смешивают в определенных соотношениях и концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах в 20-30 раз. К концентрату добавляют гель гидроокиси алюминия и затем защитную среду высушивания, содержащую сахарозу,желатину, пептон и фосфатный буфер в определенных соотношениях. Полученную смесь подвергают дополнительной инактивации мертиолятом и затем лиофилизируют. Получаемая вакцина обладает хорошей растворимостью, безвредна, стерильна, высоко активна и удобна в транспортировке и хранении. 3 з.п.ф-лы.

1. Способ получения поливалентной вакцины против лептоспироза животных, включающий отбор производственных штаммов лептоспир по серогрупповому составу, приготовление питательной среды на основе сыворотки крови, ее стерилизацию, культивирование штаммов лептоспир с последующим объединением культур, их инактивацией, концентрированием бактериальной массы, внесением адъюванта и повторной инактивацией мертиолятом, отличающийся тем, что стерилизацию питательной среды проводят микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,2 0,28 мкн, инактивацию культур осуществляют 0,1 0,3%-ным раствором формалина, бактериальную массу концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах в тангенциальном потоке со скоростью 6 10 л/ч • м², адъювант-гель гидроокиси алюминия добавляют в конечной концентрации 20 25 об. в полученную смесь вносят защитную среду высушивания, содержащую, мас. сахароза 14 26; желатина 2 6; пептон 0,5 2; фосфатный буфер остальное, и после инактивации мертиолятом подвергают замораживанию до (-45) - (-50)^oС в течение 12 14 ч, а затем высушиванию до остаточной влажности 1 4 мас. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбирают производственные штаммы лептоспир серогрупп: Иктерогеморрагия, Тарассови и Помона. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбирают производственные штаммы лептоспир серогрупп: Гриппотифоза, Тарассови, Помона и Сейро. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбирают производственные штаммы лептоспир серогрупп: Иктерогеморрагия и Каникола.