ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БИОМАССЫ ТРЕПОНЕМ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в промышленном производстве биомассы трепонем, необходимой для получения антигенов
Бледная трепонема - весьма требовательный микроорганизм. Она не растет на обычных средах, развивается при температуре 37^oС в анаэробных условиях, в средах, содержащих почечную или мозговую ткань, крайние границы роста 34-40^oС.

Хорошо развивается бледная трепонема на хориопаллантоисной ткани куриного зародыша в кроличьей сыворотке с добавлением кусочков мозговой ткани под слоем вазелинового масла.

Получение чистых культур трепонем представляет большие трудности. Продолжительное культивирование трепонем сопровождается утратой их вирулентности.

Под влиянием факторов внешней среды и лечебных препаратов трепонемы в ряде случаев свертываются в клубки, образуя цисты, покрытые непроницаемой муциноподобной оболочкой, и α-формы бактерий, они длительное время могут находиться в организме больного в латентном состоянии, при благоприятных условиях цисты превращаются в зерна, а затем в типичные спиралевидные трепонемы. Цистообразование - одна из защитных форм трепонем, позволяющая им противостоять действию препаратов, применяемых для лечения больных сифилисом (К.Д. Пяткин, Ю.С. Кривошеев, Микробиология, М., "Медицина", 1980, с. 359-360).

Наиболее распространенными питательными средами для выращивания культуральных трепонем являются среды, питательной основой которых является бульон из бычьих сердец с кусочками печени или бычьего сердца с добавлением пептона, гидролизатов, компонентов для регулирования среды, уплотняющих компонентов, например, агар-агара (Ю.А. Козлов, Питательные среды в медицинской микробиологии, М., "Медгиз", 1950, с. 203-206). Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования под редакцией М.О. Биргера, М., "Медицина", 1973, с. 47-92).

При использовании этих сред промышленное производство биомассы трепонем нереально из-за дороговизны белковосодержащих труднодоступных компонентов, времени культивирования (7-10 суток) и низкого выхода биомассы.

Были разработаны среды на основе смеси асцитической жидкости с печеночным бульоном (рН 7,4-7,6), в которых кусочки печени заменены кусочками агара. При этом наблюдалось интенсивное развитие бледной трепонемы.

Однако среды отличались сильным помутнением и возникали трудности с культивированием.

Для поддержания чистых культур пользуются жидкими питательными средами на основе мясопептонного бульона с добавлением кусочков телячьей печени в количестве 1/4 объема питательной среды с рН 8,0-8,4 и культивированием при 36-37^oС в течение 5-7 суток.

Однако эта среда непригодна при получении биомассы культур в промышленном производстве антигенов, так как кусочки печени дают муть и осадок при центрифугировании, а, также, иногда в центрифугат попадают крошки печени.

Была предложена среда, где печень заменена на кусочки мелко нарезанного круто сваренного куриного желтка в объеме 1/4 питательной среды.

Использование этой среды неэффективно для промышленного производства биомассы трепонем ввиду использования дорогостоящих пищевых продуктов.

С целью организации производства биомассы бледных трепонем было предложено в среду на мясопептонном бульоне с кусочками печени добавлять биологические стимуляторы на основе экстрактов группы растений из семейства аралиевых, например, аралия Шмидта, мака-самосейки.

Опыты по массовому выращиванию бледных трепонем на среде с добавлением мака-самосейки показали повышение роста биомассы в 2 раза.

Однако даже при таком высоком выходе готовой продукции среда неэффективна для промышленного производства ввиду дороговизны и труднодоступности компонентов. (Ученые записки Ставропольского государственного медицинского института, Ставрополь-на-Кавказе, 1959, с. 54-58).

В последнее время активно разрабатываются искусственные плотные и жидкие питательные среды для выращивания различных микроорганизмов с исключением использования пищевых и животных компонентов. В этих составах в качестве питательной основы используют гидролизат казеина, супернатант, пептон; в качестве источников азота - цистин, арганин, глутаминовую кислоту; в качестве источников углерода - глюкозу, углеводы; в качестве стимуляторов роста - экстракты кормовых дрожжей, тиамин-бромид, с добавлением агара, минеральных солей, сыворотки крупного рогатого скота (КРС) (А.С. СССР 1393849, С 12 Q 1/04, 07.05.88, Бюл. 17; А.С. СССР 1451167, С 12 Q 1/04, 15.01.89, Бюл, 2; А.С. СССР 1189098, С 12 N 1/00, 20.04.95, Бюл. 11).

Приведенные составы питательных сред не обеспечивают достаточных условий для выращивания биомассы бледных трепонем.

Наиболее близким к заявляемому составу является состав питательной тиогликолевой среды для контроля чистоты живых вакцин. Среда содержит питательную основу, источник углерода, источник азота, стимулятор роста, реактивы, обеспечивающие изотоничность раствора в его рН при следующем соотношении компонентов, г/л:
Триптический гидролизат казеина - 180-200
Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 420-440
Натрий хлористый - 0,75-0,80
Глюкоза - 5-6
Кислота тиогликолевая - 0,3-0,4
Цистин - 0,75-0,80
Агар-агар - 0,75-0,80
Сыворотка крупного рогатого скота (КРС) - 90-100
Натрий едкий и кислота соляная для корректирования рН среды -
Вода дистиллированная - До 1 л
(Инструкция по изготовлению питательной среды для контроля чистоты живых вакцин. Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", г. Саратов. Утв. IV карантинных инфекций Минздрава СССР 28.09.81).

Недостатком этого состава является использование дорогого и дефицитного продукта агар-агар, низкий выход готового продукта при приготовлении биомассы бледной трепонемы (1,05 г на 1 л среды), снижение чувствительности и специфичности антигенов. Это обусловлено недостаточным стимулирующим эффектом экстракта кормовых дрожжей. Кроме того, агар-агар повышает вязкость раствора, снижая при центрифугировании выход биомассы.

Целью изобретения является подбор состава питательной среды, обеспечивающей выращивание биомассы бледной трепонемы в промышленном производстве с использованием недорогих компонентов и сохранения необходимых антигенных свойств диагностических препаратов, повышение выхода биомассы.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для выращивания биомассы бледной трепонемы содержит следующие компоненты, г/л:
Триптический гидролизат казеина - 180-200
Экстракт пищевых дрожжей (ЭПД) - 420-440
Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - 200-210
Глюкоза - 5-6
Кислота тиогликолевая - 0,3-0,4
Цистин - 0,75-0,80
Хлористый натрий - 0,75-0,80
Сыворотку крупного рогатого скота (КРС) - 90-100
Натрий едкий и кислота соляная для корректирования рН среды
Вода дистиллированная - До 1 л
По отношению к прототипу заявляемое изобретение отличается дополнительным введением в состав среды в качестве стимулятора роста экстракта пищевых дрожжей.

Приготовление питательной среды в жидкой форме с исключением из ее состава агар-агара и введение дополнительного стимулятора роста обеспечивает повышение чистоты выращивания культуры и увеличение выхода готового продукта.

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается примерами практического выполнения.

Пример 1. В варочно-паровой котел сливают из расчета на 1 л среды 180 г гидролизата казеина, 440 г 10% экстракта пищевых дрожжей, 210 г 5%-го экстракта кормовых дрожжей, добавляют 0,75 хлористого натрия, 0,75 г цистина, предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды при постоянном добавлении 20% раствора едкого натрия до его полного растворения.

В смесь доливают дистиллированной воды до 1 л и добавляют 10% воды на выкипание, подщелачивают смесь 20% раствором натрия едкого до рН 8,0-8,2. Кипятят 20 мин без цистина и 5 мин с цистином при постоянном помешивании. Добавляют 5 г глюкозы, 0,4 г тиогликолевой кислоты, фильтруют через полотно и разливают в стерильные пробирки и бутыли, стерилизуют при 110^oС (0,5 атм). Перед посевом микроорганизмов добавляют сыворотку КРС в количестве 90 г/л.

Пример 2. Выполняется аналогично примеру 1 за исключением того, что смесь готовят из 100 г/л гидролизата казеина, 420 г/л ЭПД, 200 г/л ЭКД, 6 г/л глюкозы, 0,8 г/л кислоты тиогликолевой, 0,8 г/л цистина, 0,8 г/л натрия хлористого, 100 г/л сыворотки КPC.

Пример 3. Выполняется аналогично примеру 1 за исключением того, что смесь готовят из 200 г/л гидролизата казеина, 400 г/л ЭПД, 205 г/л ЭКД, 5,5 г/л глюкозы, 0,35 г/л кислоты тиогликолевой, 0,78 г/л натрия хлористого, 95 г/л сыворотки КРС.

Как показали результаты экспериментов, уменьшение в смеси количества питательной основы (гидролизата казеина) ниже заявляемых пределов) приводит к замедлению роста культуры; уменьшение количества ЭПД и ЭКД приводит к уменьшению выхода биомассы, снижению специфичности диагностикумов; уменьшение количества азотосодержащих и углеродосодержащих компонентов не обеспечивает полного гидролиза белковых соединений и снижает рост бактериальной массы; уменьшение количества натрия хлористого не обеспечивает изотоничность раствора; уменьшение сыворотки КРС приводит к снижению содержания белковых компонентов и соответственно снижению роста белковых компонентов.

Увеличение же количества заявляемых компонентов выше заявляемых пределов нецелесообразно, так как заявляемые пределы обеспечивают поставленную задачу.

В таблице приведены сравнительные характеристики биомассы трепонем, выращиваемых на различных питательных средах, и КСТ-антигена (клеточные стенки трепонемы, полученные из ультраозвученного дезинтеграта центрифугированием при 1•10³ по известной методике (Вестник дерматологии и венерологии 9, 1985, с. 16-18, 3, 1995, с. 14-15).

Как свидетельствуют сравнительные данные, заявляемая среда обеспечивает достаточно высокий выход биомассы, более высокий по сравнению с прототипом, более низкую стоимость антигена КБТ, выращенных на предлагаемой среде при сохранении их антигенных свойств.

Таким образом, заявляемое изобретение реально осуществимо, его использование позволит организовать промышленный выпуск биомассы из недорогих, доступных компонентов, что обеспечит в достаточной степени медицинские учреждения диагностикумами для серодиагностики сифилиса.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в промышленном производстве биомассы трепонем. Среда содержит следующие компоненты: триптический гидролизат казеина, 10%-ный экстракт пищевых дрожжей, экстракт кормовых дрожжей, глюкозу, кислоту тиогликолевую, цистин, натрий хлористый, сыворотку крупного рогатого скота, воду дистиллированную. Использование 10%-ного экстракта пищевых дрожжей как дополнительного стимулятора роста обеспечивает повышение чистоты выращивания культуры и увеличение выхода готового препарата. 1 табл.

Питательная среда для выращивания биомассы трепонем, содержащая триптический гидролизат казеина, экстракт кормовых дрожжей, хлористый натрий, глюкозу, кислоту тиогликолевую, цистин, сыворотку крупного рогатого скота, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит 10%-ный экстракт пищевых дрожжей при следующем соотношении компонентов, г/л:
Экстракт пищевых дрожжей - 420 - 440
Триптический гидролизат казеина - 180 - 200
Экстракт кормовых дрожжей - 200 - 210
Глюкоза - 5 - 6
Кислота тиогликолевая - 0,3 - 0,4
Цистин - 0,75 - 0,80
Хлористый натрий - 0,75 - 0,80
Сыворотка крупного рогатого скота - 90 - 100
Вода дистиллированная - До 1 ло