СПОСОБ ОКРАСКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, может быть использовано при морфологических исследованиях в патологической анатомии, цитологии, судебной медицине.

Существует несколько способов выявления ДНК и РНК в клетках с помощью окраски гистологических препаратов метиловым зеленым и пиронином (Паппенгейм, 1899; Унна-Паппенгейм, 1903; Браше, 1942; Треван и Шаррок, 1951; Лилли, 1954; Курник, 1952, 1955 и др.).

Указанные методы требуют применения значительного количества различных реактивов (ацетатного буфера, бутилового спирта, ацетона, фенола и т.д.), что удорожает процедуру окрашивания, достаточно продолжительны по времени и не обеспечивают стабильное качество окраски.

В частности, метод Унна-Паппенгейма, который может быть с полным основанием рекомендован для чисто гистологических целей (Меркулов Г.А., Л., 1969, с. 275-279), имеет ряд недостатков:
1) фиксация тканей требует применения специальных фиксирующих смесей (жидкость Карнуа, смесь абсолютного спирта с ледяной уксусной кислотой (1:1) и т.д.);
2) относительно большая и неопределенная продолжительность времени окрашивания в смеси - от 15-20 мин до 1-2 ч;
3) недостаточно элективная окраска ядер и отсутствие стандартности окрашивания пиронином;
4) нежелательная экстракция метилового зеленого или пиронина при ополаскивании и обезвоживании;
5) использование растворов карболовой кислоты (фенола) для приготовления смеси красителя.

Аналогом предлагаемого способа является метод Браше (1942), описанный в "Гистохимии" Э. Пирса (М., 1962, с.745).

Этот метод имеет также ряд недостатков:
1) смесь красителя хранится относительно недолго (около 1 недели);
2) неопределенно время окрашивания - от 10 мин до 24 ч, что требует конкретного выбора времени для каждого случая окраски;
3) при ополаскивании в дистиллированной воде вымывается пиронин (поэтому нужно проводить процедуру осторожно и очень быстро, что требует большого опыта);
4) обезвоживание в абсолютном ацетоне, затем в 2-х порциях смеси абсолютного ацетона и ксилола (опять-таки нужно проводить процедуру кратковременно и осторожно, т.к. происходит быстрая экстракция красителей из препарата);
5) заключение в дистрен-дибутилфталат-ксилол (препараты плохо сохраняются при заключении в канадский бальзам);
6) возможна формалиновая фиксация, но кратковременная (4-16 ч). Поэтому при необходимости невозможно сохранять фиксированные препараты, ибо после длительной формалиновой фиксации окраска по методу Браше дает плохие результаты;
7) необходимость использования М/5 ацетатного буфера с рН 4,8.

Доктор Дьердъ Кисели ("Практическая микротехника и гистохимия", Будапешт, 1962, с. 199) предлагает метод окрашивания метиловым зеленым и пиронином раствором Тафта, состоящим из 0,5 г метилового зеленого и 0,2 г пиронина в 100 мл 0,1 М ацетатного буфера с рН 4,4. Время окрашивания 10 мин. Однако промывка и обезвоживание проводится сначала в смеси абсолютного спирта и терциерного бутилового спирта, затем двукратно в сменяемом терциерном бутиловом спирте.

Недостатками данного метода мы считаем необходимость применения в смеси красителя ацетатного буфера с определенным рН и терциерного бутилового спирта. Последний, как указывает автор, довольно часто нужно сменять и при низкой температуре воздуха в лаборатории он приобретает плотную консистенцию, вследствие чего возникает необходимость расплавить его в термостате. Помимо того, окраску нужно проводить при строгом соблюдении сроков и в контролируемых условиях (раствор Тафта сохраняется недолго).

МЕТОД КУРНИКА (1952, 1955) имеет некоторые преимущества перед вышеописанными. В "Патогистологической технике и практической гистохимии" Р. Лилли (М. , 1969, с. 146) описан первоначальный вариант, предложенный Курником в 1952 г. (Kurnick, Stain Techn., 25, 233, (1952)). В этом варианте окрашивание 0,2%-ным раствором метилового зеленого в 0,01 М ацетатном буфере с рН 4,2 проводится раздельно, затем, после обезвоживания, в двух сменах н-бутилового спирта красится насыщенным или разбавленным свежеприготовленным раствором пиронина В ацетоне во избежании экстракции пиронина при обезвоживании и обработке дифференцирующими метиловый зеленый агентами.

Недостатки:
1) метод требует использования специальных фиксаторов (смесь Карнуа, холодный ацетон и др.);
2) использование ацетатного буфера;
3) необходимость обезвоживания только в н-бутиловом (или трет-бутиловом) спирте;
4) раздельное окрашивание метиловым зеленым и пиронином;
5) пригодны только определенные виды пиронина и свежеприготовленные его растворы в ацетоне;
6) обязательно просветление в кедровом масле перед заключением в смолу.

ПРОТОТИПОМ предлагаемого способа является метод Курника (1955) с применением метилового зеленого - пиронина Y для выявления ДНК и РНК (Э. Пирс, "Гистохимия", М., 1962, с.74б).

МЕТОД С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТИЛОВОГО ЗЕЛЕНОГО - ПИРОНИНА Y ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК И РНК
(Курник, 1955)
(Карнуа, Уолман, 22^o; парафиновые срезы или срезы, изготовленные в криостате)
Приготовление красителя
Приготовить 2-процентный водный раствор пиронина Y. Провести экстракцию СНСl₃, встряхивая в делительной воронке, пока слой хлороформа не перестанет окрашиваться. Приготовить 2%-ный водный раствор метилового зеленого и провести экстракцию СНСl₃, как и с пиронином, пока хлороформ не перестанет окрашиваться в фиолетовый цвет. Для использования взять смесь, состоящую из 12,5 мл пиронина Y, 7,5 мл метилового зеленого и 30 мл дистиллированной воды.

Метод
1. Довести парафиновые срезы до воды; срезы, изготовленные в криостате, можно сразу поместить в красящий раствор.

2. Окрашивать метиловым зеленым - пиронином в течение 6 мин.

3. Промокнуть фильтровальной бумагой.

4. Погрузить в две порции н-бутанола, на 5 мин в каждую.

5. Погрузить в ксилол на 5 мин.

6. Погрузить в кедровое масло на 5 мин.

7. Заключить в пермаунт.

Результат
Хроматин окрашивается в светло-зеленый цвет, ядрышки - в ярко-красный, РНК цитоплазмы - в ярко-красный, эозинофильные гранулы и остеоид - также в ярко-красный.

Недостатки:
1) метод требует использования специальных фиксаторов;
2) для обезвоживания и дифференцировки подходит только н-бутанол;
3) обязательно просветление в кедровом масле;
4) пригоден лишь пиронин Y 05564 фирмы "Gurr";
5) необходимо экстрагировать СНС1₃ не только из метилового зеленого, но и из пиронина Y, что является довольно трудоемкой процедурой;
ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью изобретения является обеспечение высокого качества окраски гистологических препаратов, упрощение, сокращение продолжительности и удешевление процедуры при сохранении стабильного выявления в клетках РНК и ДНК.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для фиксации материала вполне подходит 10%-ный нейтральный формалин (или любой другой фиксатор).

1. После депарафинизации срезы доводят до воды,
2. На срез наносят 2-3 капли 2%-ного водного раствора соли прочного синего ББ.

3. Через 5 мин сливают раствор и на срез наносят по 2 капли того же раствора и смеси метилового зеленого и пиронина G (состав: 0,6 г метилового зеленого, 0,4 г пиронина G смешивают в 20 мл глицерина и доливают 80 мл дистиллированной воды. Реактивы растворяют взбалтыванием). Препарат красится в течение 5 мин.

4. Сливают краску и ополаскивают в 2-х порциях дистиллированной воды.

5. Сушат фильтровальной бумагой досуха и дифференцируют ядра клеток в 2-х сменах 96^o этилового спирта.

6. Просветляют в 2-х сменах ксилола по 5 мин и заключают в канадский бальзам.

Результат окрашивания. Хроматин ядер окрашивается в различные оттенки зеленого цвета, РНК цитоплазмы, эозинофильные гранулы - в ярко-красный цвет. Гранулы тучных клеток - в различные оттенки красного цвета (от светло-красного до темного) в зависимости от степени грануляции и зрелости.

Реактив сохраняет способность к окрашиванию более 3-х недель независимо от способа хранения. Препараты, окрашенные по этой методике, хорошо выдерживают длительное хранение.

СОПОСТАВИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРИЗНАКОВ ПРОТОТИПА И ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Предлагаемый способ в отличие от прототипа не требует применения специальных фиксаторов.

2. Нет необходимости очищения пиронина хлороформом, что является обязательным в прототипе.

3. В предлагаемом способе можно применить любой пиронин, независимо от фирмы (в методе Курника используется пиронин Y 05564 фирмы "Gurr").

4. Вполне пригоден для обезвоживания и дифференцировки ядер 96^o этиловый спирт.

5. Споласкивание в дистиллированной воде после окраски не приводит к вымыванию красителей независимо от времени процедуры.

6. Нет необходимости применения специальных просветляющих веществ (в прототипе обязательно погружение в кедровое масло).

7. Предлагаемый способ обеспечивает стабильное окрашивание клеточных структур, возможность коррекции окраски гистологических препаратов с увеличением или снижением интенсивности окрашивания различных структур без ущерба для качества препарата, что исключено в прототипе.

8. Необязательно использование для заключения специальных смол, вполне подходит канадский бальзам.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Выписка из лабораторного журнала кафедры анатомии человека.

20.03.2000 г. После декапитации под хлороформным наркозом брали препараты брыжеечных лимфоузлов 3 белых крыс: интактной крысы ( 1\2), через 6 ч после введения в брюшную полость 2 мл физиологического раствора ( Ф6ч.2\2) и 2 мл перфторана ( F6ч.3\2) и фиксировали в 10% нейтральном формалине.

22.03.2000 г. Проведена проводка материала по гистологической батарее и заливка в парафин, затем пересадка на блоки.

23.03.2000 г. На микротоме изготовлены серийные гистологические срезы, нанесены на предметные стекла.

24.03.2000 г. После депарафинизации в ксилоле препараты перенесены сперва в 96^o, затем в 70^o спирт, после чего споласкивали в 2 порциях дистиллированной воды. На срезы нанесены по 2 капли 2%-ного раствора соли прочного синего ББ. Через 5 мин раствор сливали и наносили по 2 капли того же раствора и по 2 капли красителя (состав красителя: 0,6 г метилового зеленого и 0,4 г пиронина G смешивали в 20 мл аптечного глицерина и 80 мл дистиллированной воды). Срез красили в течение 5 мин, после чего ополаскивали в 2 порциях дистиллированной воды и сушили фильтровальной бумагой. Для дифференциации ядер использовали 2 смены 96^o этилового спирта. Заключали препараты в канадский бальзам, предварительно просветляя по 5 мин в 2 бюксах с мета-ксилолом.

ПОЛЕЗНОСТЬ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
По этой методике приготовлено более 300 гистологических препаратов лимфатических узлов, тонкой кишки и селезенки интактных и подопытных белых крыс на кафедрах анатомии человека и патологической анатомии Дагестанской государственной медицинской академии с октября 1999 г.

Предлагаемым способом изучены клеточные реакции и изменения содержания ДНК и РНК клеток брыжеечных лимфатических узлов, тонкой кишки и селезенки при экспериментальном каловом перитоните, на фоне введения перфторана и в условиях нормы.

Разработанный способ исключает использование и уменьшает расход ряда реактивов, обеспечивает стабильное окрашивание клеток и клеточных структур, позволяет корректировать интенсивность окрашивания различных структур без ущерба для качества гистологических препаратов.

Литература
1. Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия. - Будапешт, 1962, с. 199.

2. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., 1969, с.146.

3. Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники. Л., 1969, с. 275-279.

4. Пирс Э. Гистохимия. М., 1962, с. 744-746 (прототип).

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, может быть использовано при морфологических исследованиях в патологической анатомии, цитологии, судебной медицине. Способ включает проводку материала по гистологической батарее и заливку в парафин, затем пересадку на блоки. На микротоме изготовлены серийные гистологические срезы, нанесены на предметные стекла. После депарафинизации в ксилоле препараты перенесены сначала в 95^o, затем в 70^o спирт, после чего споласкивали в 2 порциях дистиллированной воды. На срезы нанесены по 2 капли 2%-ного раствора соли прочного синего ББ. Через 5 мин раствор сливали и наносили по 2 капли того же раствора и по 2 капли красителя (состав красителя: 0,6 г метилового зеленого и 0,4 г пиронина G смешивали в 20 мл аптечного глицерина и 80 мл дистиллированной воды). Срез красили в течение 5 мин, после чего ополаскивали в 2 порциях дистиллированной воды и сушили фильтровальной бумагой. Для дифференциации ядер использовали 2 смены 96^o этилового спирта. Заключали препараты в канадский бальзам, предварительно просветляя по 5 мин в бюксах с мета-ксилолом. Способ обеспечивает стабильное окрашивание клеток и клеточных структур, позволяет корректировать интенсивность окрашивания различных структур без ущерба для качества гистологических препаратов.

Способ окраски гистологических препаратов, заключающийся в окраске гистологических срезов метиловым зеленым и пиронином, отличающийся тем, что дополнительно используют 2%-ный водный раствор соли прочного синего ББ, которым предварительно протравливают препарат до нанесения смеси красителя, через 5 мин сливают раствор и на срез наносят по 2 капли 2%-ного водного раствора соли прочного синего ББ и смеси красителя следующего состава: 0,6 г метилового зеленого, 0,4 г пиронина, 20 мл глицерина и 80 мл дистиллированной воды; для дифференцировки ядер используют 96^o этиловый спирт.