СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЗОСОМНЫХ КАТИОННЫХ БЕЛКОВ ГРАНУЛОЦИТОВ И ДНК, РНК ЛИМФОЦИТОВ НА ОДНОМ ПРЕПАРАТЕ В ТКАНЯХ Российский патент 2002 года по МПК G01N1/28 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к гистохимическим исследованиям, и предназначено для одновременного определения в тканях лизосомных катионных белков (ЛКБ) в гранулоцитах и ДНК, РНК в лимфоцитах.

Изобретение может быть использовано в процессе лечения при исследовании биопсийного и операционного материала, а также в патологоанатомической и судебно-медицинской практике при диагностике аутопсий. Определение в гранулоцитах тканей ЛКБ, отражающих состояние неспецифической резистентности организма, необходимо для диагностики и лечения болезней крови и кроветворных органов и ряда воспалительных процессов. Определение структурно-функциональной характеристики лимфоцитов тканей по содержанию в них ДНК и РНК, отражающих состояние специфической резистентности организма, необходимо при диагностике и оценке степени тяжести заболеваний инфекционной природы, иммунопатологических и воспалительных процессов. Одновременное определение гранулоцитов и различной степени зрелости лимфоцитов в тканях наиболее полно отражает состояние специфической и неспецифической резистентности организма при данных заболеваниях.

Определение в гранулоцитах ЛКБ и определение в лимфоцитах ДНК и РНК одновременно и на одном гистологическом препарате ранее никогда не проводилось.

Известен способ [1] определения ДНК, РНК лимфоцитов в тканях (способ Браше), который служит прототипом изобретения и включает фиксацию материала в жидкости Карнуа, состоящей из 100^o этилового спирта, хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношении по объему 6:3:1, процедуру обезвоживания материала и заливки его в парафин, изготовление срезов и окрашивание их в красителе с соотношением по весу сухих красящих веществ метиловый зеленый-пиронин 1: 1,7, дифференцировку препарата в дистиллированной воде и ацетоне. В результате ДНК хроматина ядер окрашивается в сине-зеленый цвет, а РНК ядрышка и цитоплазмы клеток в различные оттенки розового и красного цвета. ЛКБ гранулоцитов в тканях с помощью способа Браше не выявляются.

Цель данного изобретения состоит в создании простого и надежного экспресс-метода для совместного и одновременного определения в тканях и на одном препарате ЛКБ в нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитах и ДНК, РНК во всех клетках лимфоидного ряда - от малого лимфоцита до зрелой плазматической клетки при заливке ткани в парафин, что весьма важно в медицинской практике.

Вначале для одновременного выявления ЛКБ в гранулоцитах и ДНК, РНК в лимфоцитах ткани авторами было опробовано простое совмещение методики по Браше [1] с известным способом В.Е. Пигаревского [2] определения ЛКБ в гранулоцитах, который включает обработку мазков крови или препаратов-отпечатков в 0,1% прочного зеленого в 50%-ном метиловом спирте, забуференном до pH 8,1-8,2. В результате ЛКБ гранулоцитов окрашиваются в зеленый цвет разной степени интенсивности.

При этом не удалось получить различительного прокрашивания ЛКБ в лизосомных гранулах нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, так как метиловый зеленый-пиронин абсорбируется на клетках гранулоцитарного ряда и диффузно прокрашивает их цитоплазму в красный цвет, не позволяя выявлять лизосомные гранулы в этих клетках. Причем изменение последовательности применяемых методик при их простом совмещении также не привело к положительному результату.

В итоге многочисленных поисков и экспериментов был создан оптимальный вариант обработки ткани, в результате которого получен тканевой препарат, пригодный для одновременного выявления ЛКБ в гранулоцитах и ДНК, РНК в лимфоцитах.

Данная задача была решена с помощью комбинации красящих веществ и времени их воздействия на ткань, так как простое суммирование известных методик [1, 2] не давало четкой картины наличия ЛКБ в цитоплазме гранулоцитов, а ДНК, РНК - в ядре и цитоплазме лимфоцитов. И только изменения, впервые установленные и внесенные авторами в состав фиксатора, в соотношение сухих веществ красителя и в процесс дифференцировки срезов привели к достоверным диагностическим результатам.

Сущностью данного изобретения является одномоментная фиксация в растворе прочного зеленого ЛКБ, ДНК и РНК, дающая окраску только ЛКБ, с последующей докраской исследуемых образцов ткани в красителе метиловый зеленый-пиронин, приводящей к идентификационной окраске ДНК и РНК, что позволяет достоверно определять ЛКБ, ДНК, РНК одновременно на одном препарате.

Для достижения результатов было сделано следующее.

1. По сравнению с методом Браше изменен способ фиксации материала. Вместо жидкости Карнуа, которая является фиксатором в методе Браше, был использован краситель прочный зеленый, который одновременно выполняет роль фиксатора, поскольку в нем содержится метиловый спирт в концентрации 90-100%. При более низкой концентрации метилового спирта ухудшается выявляемость ДНК, РНК в ядре и цитоплазме клеток лимфоидного ряда.

2. Уменьшено с 47,3% до 7,25% содержание дистиллированной воды в растворе красителя прочного зеленого, что позволяет исключить осмотическую деструкцию клеток в процессе фиксации кусочков тканей.

3. Увеличено с 20 минут до 36 часов время фиксации кусочков ткани. Увеличение времени фиксации и концентрации метилового спирта в красителе прочного зеленого необходимо для приближения условий фиксации к методу Браше.

4. Изменена концентрация сухих порошков красителей (весовые соотношения в 100 мл раствора) метиловый зеленый-пиронин с 1: 1,7 по методу Браше (применение которого приводит к диффузному прокрашиванию цитоплазмы нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов пиронином в красный цвет и невозможности выявления в ней лизосомных гранул) до 1:1,3 по изобретению.

5. Внесены изменения в процесс дифференцировки (извлечения из ткани избытка красителя) тканевых срезов. После применения красителя метилового зеленого-пиронина использованы вместо одной порции по методу Браше две порции: дистиллированной воды, абсолютного ацетона и ацетон-ксилола.

Только при внесении этих изменений была достигнута одновременная идентификация в клетках ткани ЛКБ, ДНК и РНК.

Способ осуществляли следующим образом.

1. Брали иссеченные для исследования кусочки ткани величиной не более 0,5-1 мм³. Для удаления избытка крови их прикладывали к фильтровальной бумаге, а затем погружали в забуфференный спиртовой раствор прочного зеленого с величиной pH 8,14-8,22 и содержали в нем 36 часов.

При приготовлении раствора красителя использовали различные марки прочного зеленого (например colouz index 42053).

Сначала приготовили буфер. Для этого 0,8 г сухого порошка три(оксиметал)-аминометано(трис) растворили в 90 мл метилового спирта и к полученному раствору добавили 7,25 мл дистиллированной воды и 2,75 мл 1 н. соляной кислоты. В приготовленном метаноловом трис-буфере растворили 0,1 г сухого красителя прочного зеленого. В результате был получен 0,1% раствор прочного зеленого в 90% метиловом спирте, забуфференном до pH 8,14-8,22. Порядок растворения веществ роли не играет. Хранили раствор красителя в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном месте. Допустимо длительное хранение его при комнатной температуре.

2. Фиксированные и окрашенные в спиртовом растворе прочного зеленого кусочки тканей проводили через этиловые спирты возрастающей крепости: 90^o - 30 минут, 96^o - 30 минут, три обработки в 100^o спирте по 30 минут, в каждой порции спирта.

3. Обезвоженный в спирте материал погружали в смесь (1:1) 100^o спирт + хлороформ на 20 минут, затем следовали две обработки хлороформом: хлороформ I 20 минут и хлороформ II 20 минут, а затем в смеси хлороформ + парафин на 12 часов, и две обработки парафином, в парафин I 40 минут и парафин II 1,5 часа. Затем следовала заливка в парафин. Из парафиновых блоков на микротоме готовили срезы толщиной 3-4 микрона.

4. Путем стандартных приемов, принятых в гистологической практике [3], срезы депарафинировали с помощью растворов ксилола и спирта, после чего переносили в раствор красителя метиловый зеленый-пиронин на 30 минут.

Раствор метилового зеленого-пиронина был приготовлен следующим образом. 150 мг метилового зеленого, предварительно промытого в хлороформе, и 195 мг сухого порошка пиронина растворяли в 2,5 мл 96^o спирта, затем к полученному раствору добавляли 20 мл глицерина и 100 мл 0,5% водного раствора карболовой кислоты. Полученный раствор тщательно перемешивали в течение 20-30 минут.

5. После окраски с целью удаления избытка метилового зеленого (окраска ДНК хроматина ядер) и пиронина (окраска РНК рибосом цитоплазмы) осуществляли многоэтапный процесс дифференцировки срезов.

Сначала срезы помещали в две порции дистиллированной воды, абсолютного ацетона и ацетона + ксилола 1:1 на 3 секунды в каждой порции. После срезы переносили в одну порцию ацетона + ксилол 1:9 на 10 секунд и в три порции ксилола на 15 минут в каждую, после чего их заключали в канадский бальзам.

Результаты окраски.

В препарате, окрашенном предлагаемым способом, цвет ЛКБ гранулоцитов: от ярко-зеленого (при высокой степени неспецифической резистентности организма) до бледно-зеленого цвета (при низкой степени); цвет РНК, содержащейся в рибосомах цитоплазмы лимфоцитов: от ярко-красного цвета (показатель интенсивного синтеза антител и высокой степени специфической резистентности организма) до бледно-розового (при соответствующих низких показателях). Цвет ДНК, содержащейся в хроматине ядер как гранулоцитов, так и лимфоцитов - сине-зеленый (причем степень его окрашиваемости не зависит от выраженности специфической и неспецифической резистентности организма), ДНК доступна для количественного цитофотометрического анализа.

Иной локализации красителей прочного зеленого и метилового зеленого-пиронина, а также неспецифической фоновой окраски препарата не наблюдали.

Таким образом, предлагаемый способ позволил добиться четкой избирательности выявления ЛКБ в гранулоцитах и ДНК, РНК в лимфоцитах, что позволило объективно оценивать степень резистентности организма.

Возможность осуществления изобретения представлена примерами. Фотографии результатов одновременного определения ЛКБ, ДНК и РНК в тканях приведены на фигуре.

Пример 1.

Пациент К., 48 лет. Клинический диагноз: Травма печени в результате дорожно-транспортного происшествия. Биопсия правой доли печени. Кусочек ткани печени размером 1 мм³ промокнули фильтровальной бумагой и погрузили в забуференный 0,1% раствор прочного зеленого в 90% метиловом спирте с pH 8,15. Через 36 часов кусочек ткани последовательно поместили на 30 минут в 90^o и 96^o этанол, а затем 3 раза по 30 минут - в свежие порции 100^o этанола. После этого кусочек ткани погрузили в смесь 100 этанола и хлороформа при соотношении компонентов 1: 1 на 20 минут, после чего произвели 2 обработки по 20 минут свежим хлороформом. Затем кусочек ткани поместили в смесь парафина и хлороформа в соотношении 1:1 на 12 часов, после этого материал погрузили в первую порцию парафина на 40 минут, после чего перенесли в свежую вторую порцию парафина на 1,5 часа. Заливка материала осуществлена в третьей порции парафина.

Приготовленный на микротоме срез в 3-4 микрона по общепринятой методике депарафинировали и погружали в раствор красителя метиловый зеленый-пиронин на 30 минут. После окраски в процессе дифференцировки срез помещали в две порции дистиллированной воды, абсолютного ацетона и ацетон + ксилола 1:1 на 3 секунды в каждой порции. Затем срез поместили в одну порцию ацетона + ксилола (1:9) на 10 секунд и последовательно в три порции ксилола на 15 минут в каждую, после чего срез заключили в канадский бальзам и подвергли микроскопическому анализу.

В препарате (фиг. а) виден нейтрофильный гранулоцит (НГ) в ткани печени с высоким содержанием в лизосомах катионных белков в виде крупных ярко-зеленых гранул. В этом же поле зрения обнаружен лимфоцит (ЛФ) с эксцентрично расположенным светлым ядром и с высоким содержанием РНК в цитоплазме, окрашенной в ярко-красный цвет. ДНК в ядрах окрашена в сине-зеленый цвет.

Заключение: Высокая степень резистентности организма.

Пример 2.

Пациент Т., 58 лет. Клинический диагноз: Компенсированный цирроз печени. Биоптат печени. Обработка кусочка ткани полностью соответствует обработке, приведенной выше, в примере 1.

В препарате (фиг. б) виден нейтрофильный гранулоцит (НГ) в ткани печени с пониженным содержанием лизосомных катионных белков в виде пылевидных гранул бледно-зеленого цвета. В этом же поле зрения обнаружен лимфоцит (ЛФ) с высоким содержанием РНК в цитоплазме, окрашенной в ярко-красный цвет.

Заключение: Низкая степень неспецифической резистентности и высокая степень специфической резистентности организма. Показатель эффективности проводимой терапии.

Пример 3.

Пациент Р. , 29 лет. Клинический диагноз: Вирусный гепатит. Аутопсия селезенки. Обработка кусочка ткани полностью соответствует обработке, проведенной выше в примере 1.

В препарате (фиг. в) виден нейтрофильный гранулоцит (НГ) в ткани селезенки с пониженным содержанием катионных белков в лизосомах в виде единичных мелких зеленых и бледно-зеленых гранул. Рядом расположена плазматическая клетка (ПК) с незначительным содержанием РНК в рибосомах цитоплазмы, которые окрашены в бледно-розовый цвет. ДНК хроматина ядер сине-зеленого цвета.

Заключение: Низкая степень резистентности организма.

Представленные иллюстрации являются примерами нормальной, измененной (в ответ на проводимую терапию) и пониженной (в ответ на заболевание) резистентности (сопротивляемости) организма. Выводы сделаны на основе анализа гистологических препаратов.

Выявление на одном препарате ЛКБ, ДНК и РНК позволяет одновременно определять нейтрофильные, эозинофильные гранулоциты и различной степени зрелости клетки лимфоидного ряда - от малого лимфоцита до зрелой плазматической клетки и делает предлагаемое изобретение универсальным экспресс-методом (за счет объединения нескольких процессов в одном).

Различия в интенсивности окрашивания гранул от светло- до темно-зеленых, связанные с неодинаковым количеством катионных белков в гранулоцитах, а также неодинаковая степень окрашивания цитоплазмы лимфоцитов, которая зависит от содержания в ней РНК и связана с выраженностью синтеза антител, позволяют оценивать их роль в диагностике поражений исследуемых органов и тканей и делает предлагаемый способ современным методом функциональной морфологии.

Предлагаемый способ отличается простотой, надежностью, 100% выявляемостью катионных белков, ДНК и РНК в гистологических парафиновых срезах, возможностью использования с диагностической и научно-исследовательской целью в любых патологоанатомических и гистологических лабораториях.

Применение методики по изобретению дает наиболее полную характеристику резистентности организма за счет одновременного определения на одном препарате состава и функциональной активности как клеток гранулоцитарного, так и лимфоидного ряда в норме и при некоторых заболеваниях.

Источники информации
1. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - Л.: Медицина, Ленинградское отделение, 1969. с. 275-279.

2. Пигаревский В.Е. Лизосомальный катионный тест. - В кн.: Клиническая морфология нейтрофильных гранулоцитов. Под ред. В.Е.Пигаревского. - Л., 1988, с. 87-101
3. Микроскопическая техника: Руководство/Под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996, с. 7-50.

Изобретение относится к медицине, а именно к гистохимическим исследованиям. Сущностью данного изобретения является одномоментная фиксация в растворе прочного зеленого ЛКБ, ДНК и РНК, дающая окраску только ЛКБ, с последующей докраской исследуемых образцов ткани в красителе метиловый зеленый-пиронин, приводящей к идентификационной окраске ДНК и РНК. Результат достигается при инкубации кусочков ткани в метанольном растворе красителя прочного зеленого при концентрации метилового спирта в нем 90-100%, являющегося одновременно красителем и фиксатором, с последующей докраской срезов метиловым зеленым-пиронином, весовое соотношение сухих красителей 1:1,3. Технический результат: способ позволяет достоверно определять ЛКБ, ДНК, РНК одновременно на одном препарате. 1 ил.

Способ определения лизосомных катионных белков гранулоцитов и ДНК, РНК лимфоцитов в тканях, включающий взятие образца ткани, его фиксацию, заливку в парафин, приготовление срезов для окраски, их окрашивание, дифференцировку, анализ срезов с помощью микроскопа, отличающийся тем, что образец исследуемой ткани объемом 0,5-1,0 мм³ сначала фиксируют в течение 36 ч с одновременным получением идентификационной окраски ЛКБ в 0,1%-ном метанольном растворе красителя прочного зеленого с уменьшением до 7,25% содержания воды в растворе красителя, затем его подвергают многоэтапному процессу обезвоживания этиловым спиртом возрастающей концентрации и хлороформом, после чего заливают в парафин и на срезе после депарафинизации и обработки красителями метиловый зеленый - пиронин в весовом соотношении 1: 1,3 с дифференцировкой в 2-х порциях дистиллированной воды, абсолютном ацетоне и ацетон-ксилоле определяют ДНК и РНК.