СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЗОСОМНЫХ КАТИОННЫХ БЕЛКОВ В ГРАНУЛОЦИТАХ ТКАНЕЙ Российский патент 2001 года по МПК A61B5/117 G01N1/28 G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, а именно к гистохимическим исследованиям, и предназначено для определения лизосомных катионных белков (ЛКБ) в гранулоцитах тканей.

Изобретение может быть использовано в патологоанатомической и судебно-медицинской практике при диагностическом исследовании аутопсийного материала. Так как ЛКБ обладает универсальной антимикробной активностью, свойствами медиатора воспаления, фактора проницаемости, стимулятора фагоцитоза, модификатора дыхательных и ферментативных процессов в клетке, изобретение позволяет осуществлять прижизненное исследование операционного материала и биопсий, полученных у больных с целью диагностики и оценки течения ряда воспалительных процессов, заболеваний инфекционнои природы, болезней крови и кроветворных органов, а также вторичных иммунодефицитных состояний.

Определение ЛКБ в тканях весьма затруднительно, и весь спектр ЛКБ ранее не осуществлялся.

Известен способ выявления ЛКБ в гистологических парафиновых срезах, основанный на применении фиксирующих смесей, содержащих сулему. Однако этот способ не нашел применения в патоморфологической практике из-за трудоемкости, длительности и многоступенчатости процесса обработки материала, необходимости использовать насыщенный раствор сулемы, являющейся сильнодействующим ядом. Находившиеся в фиксирующих смесях, содержащих сулему, ткани необходимо обрабатывать растворами иода для удаления черного осадка, образующего в виде крупинок во всем объеме ткани. Сулема обеспечивает стабилизацию и сохранение способности к положительной гистохимической реакции у ЛКБ только эозинофильных гранулоцитов. На тех же гистологических срезах ЛКБ в нейтрофильных гранулоцитах не выявляются.

Известен способ Пигаревского В.Е. по выявлению ЛКБ в гранулоцитах, основанный на способности этих белков избирательно реагировать с диахромными анионными красителями (прочный зеленый, бромфеноловый синий) при pH 8,1-8,2, При указанных значениях pH катионные белки являются единственным биополимером, с которым анионные красители могут взаимодействовать с образованием ионных связей.

Окраска катионных белков, по способу Пигаревского В.Е., раствором прочного зеленого в сочетании с азуром А легко воспроизводима и по надежности и простоте не уступает обычным цитологическим окраскам. Недостатком данного способа является то, что методика предназначена только для гематологических исследований т. к. применяется на мазках крови. Мазки крови фиксируются на стекле, после чего производят окраску. Применять этот способ для гистохимического выявления катионных белков в нейтрофильных гранулоцитах на гистологических парафиновых срезах невозможно. Разница исследуемых материалов - кровь и целевые кусочки ткани - очень велика.

Трудности в гистохимическом выявлении катионных белков в кусочках тканей возникают при их обработке в фиксирующих жидкостях. Применяемые в гистологической практике фиксирующие жидкости изменяют физико-химические свойства катионных белков и лишают их способности давать положительную гистохимическую реакцию с анионными красителями на гистологических парафиновых срезах.

Задача, которую решает данное изобретение, состоит в создании простого и надежного экспресс-метода определения в тканях лизосомных катионных белков в нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитах при заливке ткани в парафин. Окраска ЛКБ сохраняется в парафиновом блоке в течение всего времени его хранения. Результаты окрашивания являются постоянно достоверными и используются при диагностическом исследовании аутопсийного материала (патологоанатомическая и судебно-медицинская практика), а также при прижизненном диагностическом исследовании операционного материала и биопсий. Простота способа позволяет применять его в любой гистологической и патологоанатомической лаборатории.

Принципиально новым решением, сущность изобретения, является одновременная фиксация ткани и окраска ЛКБ гранулоцитов при помещении материала в раствор красителя. Роль фиксатора выполняет метиловый спирт, являющийся растворителем для красителя, быстро проникающий вместе с молекулами красителя во всю толщу исследуемого объекта. Специфичность гистохимической реакции обеспечивается величиной pH 8,14-8,22 раствора красителя. Только при указанных значениях pH катионные белки нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов становятся единственным биополимером, с которым молекулы красителя прочного зеленого реагируют с образованием прочных ионных связей. Величина pH раствора красителя поддерживается содержащимся в нем метаноловым трис-буфером с величиной pH 8,14-8,22.

Установлено, что окрашенные в кусочках ткани катионные белки сохраняются при последующем обезвоживании исследуемого материала в 96^o и 100^o-ом этиловых спиртах. Это обеспечило возможность заливки исследуемого материала в парафин и сохранение окрашенных ЛКБ в парафиновых блоках и в срезах с них.

Предлагаемый экспресс-метод определения ЛКБ в гранулоцитах тканей требует выполнения следующих условий:
1. Величина фиксируемых кусочков тканей не должна превышать 0,5-1 мм³. Нарушение этого условия приводит к неполному проникновению красителя в толщу ткани и искажению результатов проводимого исследования.

2. Содержание метилового спирта в составе раствора красителя следует довести до 70%. Снижение содержания метилового спирта в растворе красителя может вызвать в окрашиваемых кусочках тканей гемолиз эритроцитов, разрыв отдельных лизосомных гранул с высвобождением катионных белков в цитоплазму клетки, появление свободных лизосомных гранул в местах осмотической деструкции гранулоцитов.

3. Колебания значения pH метанолового буфера трис-соляная кислота не должны выходить за пределы pH 8,14-8,22.

4. Фиксацию и окраску кусочков тканей следует проводить при обычной комнатной температуре не ниже 12 и не выше 27^oC. При фиксации в термостате при температурах 37 или 56^oC в отдельных гранулоцитах выявляется не свойственная норме частичная дегрануляция и декатионизация ЛКБ гранул.

Для приготовления спиртового раствора прочного зеленого, работающего в условиях использования кусочков ткани, в методику приготовления по Пигаревскому В.Е. внесены следующие изменения.

1. В растворе красителя увеличено количество метилового спирта до 70%, что позволило обеспечить полноценную фиксацию и окраску кусочков тканей и устранить развитие в них артифициальных изменений.

2. Границы значений pH раствора красителя доведены до пределов 8,14-8,22.

3. Уменьшено до 27,25% содержание дистиллированной воды в растворе красителя, что позволило исключить осмотическую деструкцию клеток в процессе фиксации и окраски кусочков тканей.

При приготовлении раствора красителя используют любые марки прочного зеленого (colоur index 42053). Способ осуществляется следующим образом. Сначала готовится трис-буфер. Для этого 0,8 грамм сухого порошка три(оксиметол)-аминометана(трис) растворяют в 70 мл метилового спирта и к полученному раствору добавляют 27,25 мл дистиллированной воды и 2,75 мл 1н. соляной кислоты. В приготовленном метаноловом трис-буфере растворяют 0,1 грамм сухого красителя прочного зеленого. В результате получают 0,1% раствор прочного зеленого в метиловом спирте, забуференном до pH 8,14-8,22. Приготовленный указанным способом забуференный спиртовой раствор прочного зеленого удерживает постоянную величину pH в процессе длительного хранения (срок наблюдения - 6 месяцев). Хранят раствор красителя в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном месте. Допустимо длительное хранение его при комнатной температуре.

Методика гистологической обработки исследуемого материала.

1. Иссеченные для исследования кусочки тканей (величиной не более 0,5-1 мм³) прикладывают к фильтровальной бумаге (для удаления избытка крови), и затем погружают в забуференный спиртовой раствор прочного зеленого с величиной pH 8,14-8,22, и содержат в нем 24 ч.

2. Фиксированные и окрашенные в спиртовом растворе прочного зеленого кусочки тканей проводят через этиловые спирты возрастающей крепости: 90^o - 30 мин, 96^o - 30 мин, три обработки в 100^o спирте по 30 мин в каждой порции спирта.

3. Обезвоженный в спирте материал погружают в смесь (1:1) 100^o спирт + хлороформ на 20 мин, затем следуют две обработки хлороформом: хлороформ 1-20 мин и хлороформ 2-20 мин, затем в смеси хлороформ + парафин на 12 ч, и две обработки парафином, в парафине 1 - 40 мин и парафине 2 - 1,5 ч. Затем следует заливка в парафин.

Из парафиновых блоков на микротоме готовят срезы толщиной 3-4 мкм. Путем стандартных приемов, принятых в гистологической практике, срезы депарафинируются и заключаются в канадский бальзам. При докраске клеточных ядер наилучшие результаты дает азур А. На депарафинированных и заключенных в канадский бальзам гистологических срезах лизосомы нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов, а также бактерии, умерщвленные катионными белками, окрашиваются в зеленный цвет прочным зеленым, а клеточные ядра и жизнеспособные бактерии - в синий цвет азуром А. Иной локализации красителя прочного зеленого и неспецифической фоновой окраски препарата не наблюдается.

Предлагаемый способ позволяет достичь четкой избирательности выявления ЛКБ в нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитах.

Возможность осуществления изобретения представлена 4-мя примерами. Фотографии результатов определения ЛКБ в тканях приведены на чертеже.

Световой микроскоп. Увеличение х 1100.

Пример 1. Исследована печень здорового кролика.

Кусочек ткани размером 0,5 мм³ промокнули фильтровальной бумагой и погрузили в буферный раствор прочного зеленого с pH 8,14. Через 24 ч кусочек ткани последовательно поместили на 30 мин в 90^o и 96^o этанол, затем 3 раза по 30 мин - в свежие порции 100^o этанола. После этого кусочек ткани погрузили в смесь 100^o этанола и хлороформа при соотношении компонентов 1:1 на 20 мин, после чего произвели 2 обработки по 20 мин свежим хлороформом. Затем кусочек ткани поместили в смесь парафина и хлороформа в соотношении 1:1 на 12 ч, после чего материал погрузили в первую порцию парафина на 40 мин, после чего перенесли в свежую вторую порцию парафина на 1,5 ч. Заливка материала осуществлена в третьи порции парафина.

Приготовленный на микротоме срез толщиной 3-4 мкм по общепринятой методике депарафинировали и подвергали микроскопическому анализу.

В препарате (чертеж,а) виден нейтрофильный гранулоцит в ткани печени с высоким содержанием в лизосомах катионных белков в виде крупных ярко-зеленых гранул. Печень здорового кролика.

Пример 2. Исследована печень экспериментального кролика, содержащегося на атерогенном рационе (по методу Н.Н. Аничкова) в течение 4 недель. Ежедневно парентеральное введение 0,5% раствора холестерина в подсолнечном масле.

Обработка кусочка ткани полностью соответствует обработке, приведенной выше, в примере 1.

В препарате (чертеж,б) виден нейтрофильный гранулоцит в ткани печени с пониженным содержанием катионных белков в лизосомах в виде мелких зеленых и бледно-зеленых гранул, окрасившихся прочным зеленым.

Пример 3. Исследована печень экспериментального кролика, содержащегося на атерогенном рационе (по методу Н.Н. Аничкова) в течение 12 недель. Ежедневно парентеральное введение 0,5% раствора холестерина в подсолнечном масле.

Обработка кусочка ткани полностью соответствует обработке, приведенной выше, в примере 1.

В препарате (чертеж,в) наблюдаем почти полное отсутствие катионных белков в лизосомах нейтрофильного гранулоцита, находящегося в ткани печени. Видны лишь единичные лизосомные гранулы, окрасившиеся в бледно-зеленый цвет прочным зеленым.

Пример 4. Диагностическая пункция костного мозга человека.

Обработка кусочка ткани полностью соответствует обработке, приведенной выше, в примере 1.

В препарате (чертеж,г) на фоне слабоконтурирующих клеток, не относящихся к предмету исследования, выявляется нейтрофильный гранулоцит в ткани костного мозга с катионными белками в форме многочисленных лизосомных гранул, окрасившихся в ярко-зеленный цвет прочным зеленым.

Отсутствие необходимости окрашивать срезы (это происходит одновременно с фиксацией ткани), выявление как нейтрофильных, так и эозинофильных гранулоцитов на одном препарате делает предлагаемое изобретение экспресс-методом (за счет объединения нескольких процессов в одном).

Различия в интенсивности окрашивания гранул от светло- до темно-зеленых, связанные с неодинаковым количественным содержанием катионных белков, с оценкой их роли в диагностике поражений исследуемых органов и тканей, делают предлагаемый способ современным методом функциональной морфологии.

Таким образом, предлагаемый способ отличается простотой, надежностью, 100%-ой выявляемостью катионных белков в гистологических парафиновых срезах, возможностью использования с диагностической и научно-исследовательской целью в любых патологоанатомических и гистологических лабораториях.

Использование изобретения при диагностическом исследовании аутопсийного материала основано на установлении большой стойкости катионных белков и их сохраняемости в тканях в течение 72 ч после смерти. При необходимости определения прижизненного количественного содержания катионных белков в цельных кусочках тканей следует использовать аутопсийный материал ранних вскрытий (4-6 ч после смерти больного).

Изобретение позволяет расширить возможности в изучении лейкопоэза и дифференциальной диагностики лейкозов. При обследовании трепанобиопсий костного мозга, взятых с диагностической целью от больных острым лейкозом, хроническим лимфолейкозом и миелофиброзом, легко определить клетки гранулоцитарного ряда и отграничить их от других клеток крови. Консервация результатов гистохимической реакции в парафиновом блоке обеспечивает возможность через любое время осуществлять сравнительный анализ результатов лечения и особенностей течения (обострение, ремиссия) миелоидных форм лейкоза.

Изобретение позволяет количественно и качественно охарактеризовать процесс фагоцитоза, по-разному протекающий у больных в динамике развития болезней. При благоприятном течении раневого процесса в тканях раны преобладают фагоцитированные, умерщвленные катионными белками бактерии, окрашивающиеся в зеленный цвет прочным зеленым, т.е. речь идет о завершенности фагоцитоза, о высокой антимикробной ативности фагоцитарных клеток.

При неблагоприятном течении раневого процесса (снижение уровня иммунитета, развитие иммунодепрессивного состояния) в тканях раны преобладают жизнеспособные бактерии, дающие отрицательную гистохимическую реакцию на катионные белки и окрашивающиеся в синий цвет азуром А.

Внедрение изобретения в практику диагностического обследования больного (операционный материал, биопсии) поможет при ряде форм патологии, постановке правильного диагноза, оценке тяжести, стадии заболевания, эффективности проводимой терапии и прогноза.

Изобретение относится к медицине, а именно к гистохимическим исследованиям. Способ характеризуется тем, что осуществляют окрашивание и фиксацию одновременно при инкубации кусочков ткани в метанольном растворе красителя прочного зеленого: 70% - метиловый спирт, 27,25% - дистиллированная вода, 0,1 г сухого красителя прочного зеленого, при рН 8,14-8,22 в течение 24 ч, после чего в гистологических парафиновых срезах ткани определяют лизосомальные катионные белки (после депарафинирования) путем микроскопического анализа. Способ обеспечивает надежность, прост в выполнении. 1 ил.

Способ определения лизосомных катионных белков в гистологических парафиновых срезах ткани, включающий фиксацию материала, отличающийся тем, что одновременно с фиксацией проводят окрашивание путем инкубации кусочка ткани в 0,1%-ном растворе прочного зеленого в 70%-ном метаноле при pH 8,14 - 8,22 в течение 24 ч.