СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПЕРФТОРАНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ И ЖИДКИХ СРЕДАХ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/49 G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии и цитологии, может быть использовано при морфологических и цитологических исследованиях в гематологии, патологической анатомии, судебной медицине.

Перфторан - плазмозаменитель на основе перфторорганических соединений (ПФОС), который обладает полифункциональными свойствами: нормализует газообмен и метаболизм, транспортирует кислород и углекислый газ, стабилизирует клеточные мембраны, корригирует реологические свойства крови и расстройства микроциркуляции, нормализует центральную гемодинамику, обладает сорбционными и диуретическими свойствами. Перфторан широко применяется при лечении геморрагического шока, отравлений и интоксикаций, гемодинамических нарушений, гипоксических состояний, нарушений мозгового кровообращения, в кардиохирургии, офтальмологии и трансплантологии.

Существует единственный способ выявления перфторорганических соединений (ПФОС) в образцах биологических тканей: обнаружение ПФОС в крови с помощью газохроматографического метода (Yamanouchi, 1975). Газохроматографический метод труден в выполнении и требует дорогостоящей аппаратуры и длителен по времени.

Способ окраски перфторана в тканях не существует, соответственно, аналогов и прототипов нет.

Цель изобретения
Целью изобретения является разработка метода окраски перфторана для его выявления в биологических тканях и жидкостях.

Сущность изобретения
Можно использовать любой биологический материал (мазки крови, жидкости серозных полостей, мазки - отпечатки органов и тканей, замороженные срезы органов и тканей).

1. Мазок или срез ткани сушат при комнатной температуре с частичной кратковременной фиксацией жаром (над горелкой спиртовки).

2. На предметное стекло с мазком или замороженным срезом ткани на 10 мин наносят 5% спиртовый раствор йода (официнальная аптечная расфасовка).

3. Сливают йодный раствор, просушивают фильтровальной бумагой и погружают предметное стекло в дистиллированную воду (2 порции).

4. Быстро ополаскивают в 96 градусном этиловом спирте (можно использовать спирт на несколько препаратов, т.е. повторно), погружают в дистиллированную воду. Ополаскивание в спирте при необходимости можно повторить.

5. На предметное стекло наносят 1% водный раствор эозина на 1-2 мин.

6. Сливают эозин и препарат погружают в дистиллированную воду (в 3 порции по 1-2 мин).

7. Подсушивают на воздухе и заключают в глицерин.

Результат окрашивания
Частицы эмульсии перфторана окрашиваются в сиренево-фиолетовый цвет с черно-фиолетовым ободком и определяются в цитоплазме клеток (макрофагов), на поверхности некоторых клеток (особенно эритроцитов), плазме крови и тканевой жидкости.

Препараты необходимо хранить в темном месте при комнатной температуре. Окраска сохраняется более 1 недели.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Выписка из лабораторного журнала кафедры анатомии человека.

12.10.2000 г. Первая серия опыта - под хлороформным наркозом в брюшную полость 5 белым крысам введено по 3 мл перфторана, 5 крысам - такое же количество физиологического раствора и еще 5 крысам такое же количество гемодеза. Животных декапитировали под хлороформным наркозом. Для исследования использовали ткань брыжеечных лимфатических узлов, селезенки, печени, легких (по 3 предметных стекла с замороженными срезами каждого органа), мазки перитониальной жидкости и мазки-отпечатки перечисленных органов (по 3 предметных стекла с каждого органа).

В этот же день, т.е. 12.10.2000 г., у 1 крысы под хлороформным наркозом взяли инсулиновым шприцом 1,5 мл крови из яремной вены, предварительно разрезав кожу и обнажая вену над ключицей, и ввели туда 1,5 мл перфторана. Контрольным крысам аналогично ввели по 1,5 мл физиологического раствора и гемодеза - вторая серия опыта.

Забор материала в первой серии производили 13.10.2000 г., 14.10.2000 г., 15.10.2000 г. и 19.10.2000 г. по истечении 6, 24, 48, 72 часов и 7 суток после введения перфторана, физиологического раствора и гемодеза.

Во второй серии брали кровь (для приготовления мазков) из хвостовой вены крысы в сроки через 15 минут, 2, 4, 24, 48 и 72 часа после введения перфторана (в контроле - после введения гемодеза и физиологического раствора соответственно). Затем у крысы взяли органы (печень, брыжеечные лимфатические узлы, селезенка, почка, легкое) и приготовили мазки - отпечатки органов и замороженные срезы.

Окраска препаратов
По 1 препарату из каждой серии окрашивали по предлагаемой методике, по 1 препарату окрашивали по методике, упуская пункты 3 и 4, т.е. окраска только эозином без предварительной обработки раствором йода и по 1 препарату окрашивали гематоксилином-эозином также без применения раствора йода.

Результат
В препаратах в серии с перфтораном при окраске раствором йода и эозином определяются черно-фиолетовые частицы как внутри клеток, так и вне их.

Эозин используется для выявления клеток с целью контрастирования и распознавания локализации окрашенных частиц эмульсии в структурах органа. В контрольных препаратах (физиологический раствор и гемодез) подобная картина не определялась.

Полезность предложения. По предлагаемой методике изготовлено более 350 препаратов (мазков, мазков-отпечатков, замороженных срезов) брыжеечных лимфатических узлов, печени, селезенки, легких, почки на кафедрах анатомии человека и патологической анатомии Дагестанской государственной медицинской академии.

Предлагаемый способ позволяет определять присутствие перфторана в биологических тканях и средах. Разработанный способ прост в выполнении и не требует дорогих реактивов и является пока единственным для выявления перфторана в тканях и биологических жидкостях методом его окраски.

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии и цитологии, может быть использовано в цитологических и морфологических исследованиях в гематологии, патологической анатомии, судебной медицине, а также для изучения динамики циркуляции перфторана в организме. При этом на предметное стекло с мазком или замороженным срезом ткани на 10 мин наносят 5%-ный спиртовый раствор йода (официнальная аптечная расфасовка), сливают йодный раствор, просушивают фильтровальной бумагой и погружают предметное стекло в дистиллированную воду, быстро ополаскивают в 96 градусном этиловом спирте, погружают в дистиллированную воду. На предметное стекло наносят 1%-ный водный раствор эозина на 1-2 мин. Сливают эозин и препарат погружают в дистиллированную воду (в 3 порции по 1-2 мин), подсушивают на воздухе и заключают в глицерин и с помощью микроскопа обнаруживают окрашенные черно-фиолетовые частицы перфторана. Способ обеспечивает простоту выполнения, не требует дорогих реактивов.

Способ выявления перфторана в биологических тканях и жидких средах, отличающийся тем, что на предметное стекло с мазком - отпечатком или с замороженным срезом ткани - наносят 5%-ный спиртовой раствор (официнального) йода, через 10 мин сливают раствор, подсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают сначала в дистиллированной воде, затем быстро в 96-градусном спирте и опять в дистиллированной воде, после чего наносят 1%-ный водный раствор эозина на 1-2 мин, промывают в воде, заключают в глицерин и с помощью микроскопа обнаруживают окрашенные черно-фиолетовые частицы перфторана.