Способ изготовления препаратов зародышевых мешков растений Советский патент 1979 года по МПК G01N1/28 A01G7/00 

(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ЗАРОдаЩЕВЫХ МЕШКОВ РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к области микроскопической техники и может быть использовано при приготовлении наглядных пособий для школ, техникумов и вузов, а также в сельском хозяйстве для интенсификации генетико-селекционных работ и в научных учреждениях ботанического профиля для ускорения научных исследований...

Известен способ выделения зародышевых мешков растений путем мацерации тканей. Его сущность сводится к мацерации фиксированных семяпочек ферментами желудочной железы улитки, нарушению целостности окружающих тканей путем использования специальных мешалок и центрифуг, последующему окрашиванию взвеси в пробирках ацетокармином и изготовлению-врёТйённых препаратов 1.

Этот способ изготовления препаратов целых зародышевых мешков имеет ряд недостатков:

препараты являются временными, т.е. пригодными лишь к кратковременному использованию (в течение 2-3 недель) ;

требуется применение специешьной аппаратуры - центрифуг, мешалок, электромоторов и т.п.;

в процессе центрифугирования часть зародышевых мешков неизбежно подвергается механическим повреждениям и только несколько десятков их остаются целыми;

на препарате получается суспензия соматических клеток и зародышевых мешков, что мешает изучению зародышевых мешков;

препараты не являются контрастно окрашенными.

Наиболее широко распространенным в эмбриологических исследованиях является способ приготовления микротомных (разрезанных на ряд срезов), постоянных препаратов 2.

Данный способ Заключается в следующем. Исследуемый материал (чаще всего завязи или семяпочки) фиксируют, например ГАА (формапин, спирт, уксусная кислота), промывают от фиксатора 70%-ным спиртом, обезвоживают спиртами повышающейся концентрации от 70 до 100%, далее спирт замешают хлороформе или ксилолом для последующей пропитки исследуемого материала парафином, которую проводят в термостате в течение суток Пропитанный парафином материал охлаждают, монтируют в парафиновые блоки и режут на микротоме на ряд тонких срезов, которые монтируют на пpeд 1eтныx стеклах и сушат в термостате в течение 1-3 суток. Высушенные срезы, смонтированные на пред метном стекле, окрашивают, для чего предварительно с них удаляют парафин ксилолом, ксилол спиртом и срезы про мывают водой. Окрашенные препараты обезвоживают 100%-ным спиртом, обрабатывают ксилолом, заключают в канад ский бальзам и закрывают покровным стеклом. К- недостаткам указанного способа относятся чрезвычайная длительность и трудоемкость (при максимальной скорости работы готовый препарат мож но получить лишь через 16-18 суток) невозможность получения целых зародышевых мешков растений, так как при резке исследуемого материала на микротоме зародышевый мешок оказывается разрезанным на несколько частей, что затрудняет его исследование под микроскопом. Целью изобретения является ускоре ние и упрощение изготовления препа ратов целых зародышевых мешков растений (контрастно окрашенных в массовом количестве) Указанная цель достигается тем, что окрашивание исходного материала осуществляют непосредственно после фиксации и промывки, а после мацера и;ии препарирование семяпочек провод путем надрыва их кутику ы и извлечения зародышевых мешков, последние переносят капилляром на фильтровальную бумагу, помещая ее на предметное стекло, а обезвоживание этанолом Иобработку их ксилолом произ водят путем прокапывания. Для закрепления зародышевых мешков на месте во время обезвоживания их кладут на отрезок фильтровальной бумаги, расположенной горизонтально на предметном стекле. Для сохранения целостности пропи танных ксилолом зародышевых мешков при переносе на чистое предметное стеклозародышевые мешки собирают прикосновением к ним капли густого (тянущегося) канадского бальзама, расположенной на конце тупой препаровальной иглы, и последующим погружением этой капли с объектом в ксилол, нанесенный на предметное стекло. Для отделения зародышевых мешков из суспензии соматических клеток в цитазу помещают каплю воды и переводят зародышевые мешки из цитазы а воду при помощи препаровальной иг Указанные отличия позволяют исключить применение специальной аппаратуры - микротомов, термостатов, центрифуг и т.п., ряд операций и часть реактивов (например, замену спирта хлороформом или ксилолом, пропитку материала парафином, резку на микротоме) и, следовательно, ускорить процесс (не 16, а 4 суток), упростить его, снизить трудоемкость изготовления препаратов, избежать нарушения целостности зародышевых мешков растений и освободить их от соматических клеток. Кроме того, эти отличия позволяют обезвоживание и окраску проводить в пробирках, а не на предметных стеклах, что уменьшает расход реактивов и позволяет одновременно обработать большое количество зародышевых мешков, которые могут монтироваться на одном предметном стекле. Проведение окраски по Фельгену непосредственно после фиксгации и промывки исходного материала дает возможность окрасить зародышевые мешки внутри целых неразрушенных органов растений, что предотвращает возможность порчи и потери исследуемого объекта при его микроскопических размерах. Использование фильтровальной бумаги при обезвоживании и мацерации позволяет закрепить микроскопические Зародышевые мешки на предметных стеклах без помощи специального клеящего веществао Пример. Материал фиксируют фиксатором ГАА, промывают и хранят в 70%-ном спирте. Фиксированные колоски или цветки в пробирках промывают 4-5 ч дистиллированной водой при комнатной температуре. Затем проводят колодный гидролиз, В первой пробирке в 1 н. соляной кислоте материал выдерживают 1 ч и в 5 и. соляной кислоте - 1,5 ч, во второй в 1 н, соляной кислоте выдерживают 1 ч. После гидролиза материал помещают в реактив Шиффа и выдерживают 16-17 ч в холодильнике при 2-4°С, промывают водопроводной водой 3-4 ч, подкрашивают гематоксилином Эрлиха или другими красителями (время подкраски устанавливают опытным путем в зависимости от концентрации красителя ) , промывают дистиллированной водой 1-2 ч, выделяют завязи (т.е. часть цветка, внутри которой располагается семяпочка с зародышевьзм мешком и соматическими клетками) , помещают в концентрированный фермент литазу на предметное стекло с углублением и оставляют на 24 ч во влажной камере чашки Петри при комнатной температуре. Мацерированный материал переносят на предметное стекло Препарируют .под бинокулярной лупой Наружную оболочк семяпочки осторожно нгщрывают тонко отточенными препаровальными иглаг-та и зародышевый -мешок ВЕЛЧлеияют из семяпочки вместе с частью соматических клеток. Затем в суспензию клеток в цитазе вводят 1-2 капли дистиллированной воды. Соматические клетки удерживаемые остатками цитазы, остаются на стекле. Зародышевый мешок с помощью иглы в капле воды переводя во взвешенное состояние, затем переносят капилляром (диаметр 0,2 мм) на отрезок фильтровальной бумаги 2x2 см, лежащий на предметном стекле и предварительно увлажненный дистиллированной водой. Зародышевый мешок оказывается на бумаге почти без суспензии соматических клеток. Перенеся на бумагу несколько зародышевых мешков, их обезвоживают непосредственно На предметном стекле, расположенном горизонтально. Сначала с од ного края бумаги наносят несколько капель 40%-ного спирта, а с противоположной стороны подводят сухую филь ровальную бумагу, которая всасывает избыток жидкости. В этом спирте выдерживают 10 мин. Таким же образом проводят операции с 50, 70, 96 и 100%-ным спиртом,выдерживая объект п 10 мин в каждом из спиртов.Все работ по обезвоживанию на предметном стекл проводят в чашках Петри, Предметное стекло с материалом, заключенным в ксилол, переносят под бинокуляр и ту пой иглой, предварительно смоченной rycTbiM канадским бальзамом, осторожными прикосновениями к зародьаневым мешкам собирают их на кончик иглы, переносят в каплю ксилола на чистое предметное стекло и покрьгаают покров ным. Полученные препараты сушат в термостате при 42 С. Предлагаемыь1 способом изготавливают постоянные препараты, которые могут храниться длительное время, что позволяет вернуться к их изучению и создать документированность эмбриологического исследования. изобретения Способ изготовления препг ратов зародышевых мешков растений, включающий фиксацию исходного материала, промывку, обработку его ферментом цитаза при мацерации завязей или семяпочек, препарирование, окрашивание, обезвоживание.этанолом, обработку ксилолом, заключение в канадский бальзам, помещение объекта на предметное стекло для .последующего микроскопирования, отличающийс я тем, что, с целью ускорения и упрощения изготовления препаратов целых зародышевых мешков, окрашивание исходного материала проводят непосредственно после фиксации и промывки, а после мацерации препарирование семяпочек проводят путем надрыва их кутикулы и извлечения зародьзшевых мешков, последние переносят капилляром на фильтровальную бумагу, помещая ее на предметное стекло, а обезвоживание этанолом и обработку их ксилолом проводят путем прокапывания. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Бналаева Н.Х. и др. Цитологии и генетика, т.6, вы.п5, 1972. 2.Дженсен У. Ботаническая гистохимия, Мир, 1965, с. 59-77 (про-тотип).