ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЛЮЦЕРНЫ SINORHIZOBIUM MELILOTI АК55-СИМБИОТИЧЕСКИЙ АЗОТФИКСАТОР ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ АГРОКЛИМАТИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 A01N63/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, а именно к новым штаммам клубеньковых бактерий, оказывающим стимулирующее воздействие на рост люцерны в различных агроэкологических условиях.

В связи с дефицитом растительного белка все большее внимание ученых привлекают проблемы, связанные с повышением продуктивности почв, обогащения их элементами питания и в первую очередь азотсодержащими веществами (т.к. именно азот находится в набольшем дефиците для растений в почве). При этом особенно важное значение имеет фиксация азота с помощью микроорганизмов, позволяющая преобразовывает атмосферный азот в форму, которая может использоваться растениями. Кроме того, биологически фиксированный азот (в отличие от азота минеральных удобрений) является экологически безопасным. В растениях семейства бобовых (Leguminoseae), симбиотическое взаимодействие между растениями и азотфиксирующими бактериями семейства Rhizobiaceae усиливает рост растений, повышает их урожайность и накопление протеина. (RU 2508631, 2009; Ferguson и Mathesius, J. Plant Growth Regulation 22: 47-72, 2003).

В целях использования дешевого биологического азота в настоящее время во многих странах наблюдается тенденция увеличения посевных площадей бобовых культур; большое внимание уделяется практике применения бактериальных удобрений. Среди бобовых культур люцерна занимает особое место, как повсеместно распространенная (экологически пластичная) и в ряде регионов страны культивируемая дважды в год. Однако, несмотря на большое значение люцерны, ее урожайность в ряде случаев относительно невысока. Это объясняется рядом неблагоприятных агроэкологических условий и, в частности, отсутствием высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий, эффективных для различных генотипов люцерны. В этой связи практически важным является разработка оптимальной технологии культивирования люцерна, в рамках которой одной из важных стадий является обработка семян люцерны препаратами, содержащими активные штаммы азотфиксирующих бактерий, способных образовывать высокоэффективный симбиоз в различных почвенно-климатических условиях (RU 2025484, 2012; RU 2514217, 2014; CN 104025865, 2014; CN 102845204, 2013; CN 102755991, 2012; CN 104068293, 2014).

В настоящее время существует более 200 видов микроорганизмов способных к симбиотической фиксации азота. В частности, для повышения урожайности люцерны предлагается использовать штаммы, Sinorhizobium meliloti 421а (RU 549454, 1977) Sinorhizobium meliloti 425a (RU 549454, 1977), Sinorhizobium meliloti 441 (RU 629204, 1978), Sinorhizobium meliloti 443a (RU 745887, 1980), Sinorhizobium meliloti 450a (RU 881095, 1981) Sinorhizobium meliloti RCAM00826. (RU 2299188 2007). Однако азотфиксирующая способность этих штаммов часто ограничивается особенностями региональных агроэкологических условий и активностью аборигенных микробных популяций.

Наиболее близким по достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является штамм Rhizobium meliloti 415b, разработанный ВНИИСХМ и показавший лучшие результаты при культивировании люцерны изменчивой (Т.Н. Троян, Ю.Н. Бургардт Агроэкологическая оценка продуктивности люцерны изменчивой при инокуляции семян производственными штаммами (http://www.rusnauka.com/13 NPT 2008/Biologia/31476.doc.htm). Однако эффективность данного штамма существенно меняется при использовании в различных почвенно-климатических условиях, в частности, он малопригоден для зоны подзолистых почв.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось получения симбиотического штамма с повышенной эффективностью симбиоза, обеспечивающего более высокий урожай люцерны на фоне широкого спектра агроэкологических условий.

Технический результат достигается созданием штамма бактерий Sinorhizobium meliloti АК55, депонированного в Коллекции ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под № RCAM 00051. (Справка о депонировании прилагается).

Штамм характеризуется следующими показателями.

Родовое, видовое название, номер. Sinorhizobium meliloti АК55.

Происхождение. Штамм выделен из клубеньков люцерны Melilotus off., собранной в Челкарской обл. (Мугоджары), Казахстан.

По какому определителю, руководству идентифицирован. Определитель бактерий Берджи. Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльямса. Девятое издание. В двух томах. Москва «Мир», 1997.

Свойства, практическая ценность культуры. Штамм представляет практическую ценность. Образует эффективный симбиоз с люцерной изменчивой и другими сортами люцерны в различных агроэкологических условиях.

Культурально-морфологические, физико-биохимические особенности культуры:

- Форма колоний - на среде TY образуют округлые слизистые колонии беловатого цвета.

- Форма клеток и подвижность - подвижные, палочки, 0,5-0,9×1,2-3,0 мкм.

- Окраска по Грамму – грамотрицательные.

- Жгутикование – полярное.

- Спорообразование - спор не образует.

- Наличие пигмента - вырабатывает меланин.

- Дыхание, форма усвоения углеводов - аэроб, рост на среде с углеводами сопровождается обильным образованием внеклеточной слизи полисахаридной природы.

- Отношение к источникам азота - источниками азота могут служить соли аммония, нитрат, нитрит и большинство аминокислот.

- Образование индола, сероводорода – нет.

- Кислотоустойчивость - средне кислотоустойчивый.

- Анаэробный тест - строгий аэроб.

- Восстановление нитратов – восстанавливает.

- Разжижение желатины - не разжижает.

- Молоко с лакмусом – подщелачивает.

Способы и условия хранения: Выращивание на средах: TY, 79, бобовый агар в течение 2-3 суток. Суспензию замораживают при температуре при температуре 25-26°С, высушивают при температуре 45-50°С и закрывают в пенициллиновые флаконы. Флаконы с лиофильно-высушенными клетками сохраняют при температуре 4-6°С.

Диссоциация культуры: не диссоциирует.

Штамм используется следующим образом. Семена люцерны обрабатывали суспензией клубеньковых бактерий Sinorhizobium meliloti из расчета 600 грамм препарата на 1 тонну семян. Норма расхода рабочего раствора 10-15 литров на тонну.

Проведенные испытания показали, что заявляемый штамм обеспечивает более высокую эффективность симбиоза по сравнению с аналогами на различных сортах люцерны, на различных почвах и в различных агроклиматических условиях. Промышленная применимость штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Исследования проводились в 2008-2010 гг. на полях СПб государственного аграрного университета (Ленинградская обл.). Почва опытного участка дерново-слабоподзолистая, среднесуглинистая, содержание гумуса 2,4-2,7%, рН -5,9-6,3; окультуренная. Площадь делянки 4 м². Полученные результаты приведены в таблице 1.

Пример 2. Исследования проводились в 2009-2011 гг. на полях Калининградского НИИ сельского хозяйства. В опыте изучалось влияние различных препаратов сорт люцерны Вега-87.

Для создания микробно-растительной системы были использованы микробиологические препараты ВНИИСХ М: штаммы Sinorhizobium meliloti А-1, А-2, А-3, А-4, 415б.

Почва опытного участка - дерново-подзолистая, среднесуглинистая, содержание подвижного фосфора 18,5, обменного калия 30,1 мг на 100 г почвы, гумуса 2,3, рН -5,12. Предшественник - тимофеевка луговая. Посев беспокровный третья декада июня 2009 года вручную. Площадь делянки на семена 1,2 м, повторность четырехкратная. Расположение делянок систематическое.

Методика исследований: фенологические наблюдения; фитосанитарный мониторинг посевов, определение семенной урожайности. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Учет урожая провели в начале третьей декады августа. Массу, убранную серпами, подсушивали, обрывали соцветия и оттирали. Из провеянной массы были отделены щуплые и невыполненные семена.

Наилучший результат отмечен и растений люцерны, инокулированных штаммом АК55, который составил 259,0 кг/г, обеспечив прибавку урожайности в сравнении с контролем на 45 кг/га (+27%).

Пример 3. Исследования проводились в 2009-2010 г. на полях Брянской сельскохозяйственной академии (Брянская обл., Выгоничский р-н, пос. Кокино).

Серая лесная почва характеризовалась следующими показателями: содержание гумуса - 2,7%, рН (сол.) - 5,6; содержание подвижного фосфора 163,5 (по методу Чирикова, обменного калия 115,5 мг на 100 г почвы. Предшественники картофель (2007 г.), ячмень (2008 г.). Полученные результаты приведены в таблице 3.

Все испытанные штаммы показали положительный результат, повысив продуктивность люцерны на 16-28%. Набольшую прибавку обеспечило применение штамма АК55, который повысил урожай люцерны на 28% и достоверно превосходил по эффективности все испытанные в опыте штаммы клубеньковых бактерий.

Пример 4. Исследования проводились в 2011 г. на полях Приморского НИИ сельского хозяйства (Приморский край, г. Уссурийск). Лугово-бурая почва характеризовалась следующими показателями: содержание гумуса - 5,7%, рН (сол.) - 5,6; содержание подвижного фосфора 13,5 (по методу Кирсанова), обменного калия 11,5 мг на 100 г почвы. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Все испытанные штаммы показали положительный результат, повысив продуктивность люцерны на 12-38%. Набольшую прибавку обеспечило применение штамма АК55, который повысил урожай люцерны на 38% и достоверно превосходил по эффективности все испытанные в опыте штаммы клубеньковых бактерий.

Пример 5. Исследования проводились в 2014 г на полях Узбекского НИИ селекции и семеноводства (Ташкентская обл.).

Экспериментальный участок посевной площади 5,2 соток был разделен на 4 части. В каждой части по 17 повторностей по 1 кв.м; между повторностями оставлено по 50 см. Тип почвы - серо-бурые пустынные почвы.

Серо-бурая почва характеризовалась следующими показателями: содержание гумуса - 1,0%, рН (сол.) - 8,1; содержание валового фосфора 0,15; общего калия 1,33; общего азота -0,07%. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Все испытанные штаммы показали положительный результат, повысив продуктивность люцерны на 24-46%. Набольшую прибавку обеспечило применение штамма АК55, который повысил урожай люцерны на 46% и достоверно превосходил по эффективности все испытанные в опыте штаммы клубеньковых бактерий.

Пример 6. В 2014 году в ФГБНУ «ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса», г. Лобня проводили изучение эффективности различных штаммов клубеньковых бактерий с перспективным селекционным номером люцерны изменчивой Л10-2 для получения семян. Предпосевная инокуляция семян проводилась методом их опудривания препаратом на основе данного штамма.

Характеристика участка. Почва дерново-подзолистая, средне окультуренная, почва характеризовалась следующими показателями: содержание гумуса - 1,7%, рН (сол.) - 5,1; содержание подвижного фосфора 34,3 (по методу Кирсанова), обменного калия 14,9 мг на 100 г почвы. Площадь делянки: длина: 4,0 м ширина: 0,45 м Полученные результаты приведены в таблице 6.

Все испытанные штаммы показали положительный результат, повысив продуктивность люцерны на 23-63%. Набольшую прибавку обеспечило применение штамма АК55, который повысил урожай люцерны на 63% и достоверно превосходил по эффективности все испытанные в опыте штаммы клубеньковых бактерий.

Пример 7. В 2014 году в ФГБНУ «ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса», г. Лобня проводили изучение эффективности различных штаммов клубеньковых бактерий с перспективным селекционным номером люцерны изменчивой Таисия для получения семян. Предпосевная инокуляция семян проводилась методом их опудривания препаратом на основе данного штамма.

Характеристика участка. Почва дерново-подзолистая, средне окультуренная. Почва характеризовалась следующими показателями: содержание гумуса - 1,7%, рН (сол.) - 5,1; содержание подвижного фосфора 34,3 (по методу Кирсанова), обменного калия 14,9 мг на 100 г почвы. Площадь делянки: длина: 4,0 м ширина: 0,45 м Полученные результаты приведены в таблице 7.

Все испытанные штаммы показали положительный результат, повысив продуктивность люцерны на 50-93%. Набольшую прибавку обеспечило применение штамма АК55, который повысил урожай люцерны на 93% и достоверно превосходил по эффективности все испытанные в опыте штаммы клубеньковых бактерий.

Пример 8. Исследования проводились в 2013 г. на полях СПб государственного аграрного университета (Ленинградская обл.).

Характеристика участка. Почва дерново-подзолистая, слабоокультуренная. Почва характеризовалась следующими показателями: содержание гумуса - 1,7%, рН (сол.) - 4,7; содержание подвижного фосфора 15,3 (по методу Кирсанова), обменного калия 8,3 мг на 100 г почвы. Площадь делянки: 1,8 м²; длина - 4,0 м, ширина: 0,45 м. Полученные результаты приведены в таблицах 8 и 9.

Все испытанные штаммы показали положительный результат, повысив продуктивность люцерны на 46-108%. Набольшую прибавку обеспечило применение штамма АК55, который повысил урожай люцерны на 108% и достоверно превосходил по эффективности все испытанные в опыте штаммы клубеньковых бактерий.

Полученные результаты показали, что заявляемый штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium meliloti АК55 по сравнению с другими штаммами ризобий позволяет существенно повысить урожайность различных сортов люцерны в широком диапазоне агроклиматических условий

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium meli-loti АК55 депонирован в Коллекции ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под №RCAM 00051 и может быть использован для повышения урожайности люцерны. Штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium meli-loti под регистрационным номером №RCAM 00051 обладает стимулирующим воздействием на рост люцерны в различных агроэкологических условиях. Изобретение позволяет повысить выход люцерны. 9 табл., 8 пр.

Штамм клубеньковых бактерий люцерны Sinorhizobium meliloti AK55, депонированный в Коллекции ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под № RCAM 00051, эффективный симбиотический азотфиксатор в различных агроклиматических условиях.