Штамм бактерий RнIZовIUм тRIFоLII, используемый для получения нитрагина под луговой клевер Советский патент 1990 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

(Л

с

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый эффективный штамм клубеньковых бактерий, используемый для изготовления нитрагина под луговой клевер. Целью изобретения является создание нового штамма клубеньковых бактерий, обладающего повышенной эффективностью в симбиозе с луговым клевером. Штамм RHIZOBIUM TRIFOLII выделен из клубеньков лугового клевера и депонирован в коллекции ВНИИСХМ N1360. Штамм позволяет увеличить урожай лугового клевера на 2,6 ц/га абсолютно сухой массы клевера по сравнению с известным штаммом. 2 табл.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый эффективный штамм клубеньковых бактерий, используемый для изготовления нитрагина под луговой клевер.

Цель изобретения - создание нового штамма клубеньковых бактерий, обладающего повышенной эффективностью в симбиозе с луговым клевером.

Штамм Rhizobium trifolii P 99 депонирован в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под № 1360 н характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки: в молодом возрасте бактерии палочковидные, размер клеток на гороховом агаре после 48 ч инкубации 0,8 х х 2,2 мк„ Хорошо окрашивается в красный цвет раствором 30%-ного эритрози- на и 5%-ного фенола.

Физиолого-биохимические свойства: органические среды. На гороховой среде (рН 7,0-7,2) колонии гладкие (форма S), круглые с ровными краями. Диаметр колоний семисуточной культуры при температуре выращивания 25 С 17 мм. Активность фермента каталазы на 1 г биомассы 11,2 - 11,5 мг НгОг за 30 мин. На среде МПА или ПА рост полностью отсутствует.

Синтетическая среда Норриса с дрожжевым экстрактом. Колонии гладкие (форма S), с ровными краями. Диаметр пятисуточной культуры 16-18 мм.

Отношение к источнику углерода. Усваивают глюкозу, сахарозу, галактозу, мальтозу, лактозу, рафннозу, ман- нит с небольшим подкислением среды. Лучше всего усваивает сахарозу на

ел

СЛ 01

СО

агаризсэванных средах, давая более плотную биомассу.

Отношение к источникам азота. Использует азот NH4N03, (NH4)SO, KN03 и карбамида CO(NH4).

Молоко пептонизирует с образованием прозрачного кольца на поверхности среды, которую подщатачивают до рН 7Д.

Крахмал и клетчатку не гидроли- зует.

Нитраты восстанавливает. Температурный оптимум роста 27,5 С Оптимальная реакция среды рН 6,5. На синтетической среде Норриса наблюдается рост при рН 4,4-10,0.

Штамм Р 99 хранится на косом бобовом агаре в биологических п робирках при температуре 5°С. Ежегодно прово- дятся два пересева на бобовом агаре и мясо-пептонном агаре (МПА) для установления чистоты культуры.

Эффективность нового штамма Р 99 по сравнению с известными штаммами 348а и 3296 клубеньковых бактерий клевера изучали продолжительное время вегетационными (1976-1980 гг) и полевыми (1980-1987 гг) опытами в условиях дерново-подзолистых глеевых легких суглинков (pHkcg5S2-6,0). Возделывали луговой клевер сорта Лепс- на, норма высева семян - 16 кг/га из расчета 100% хозяйственной годности. Подопытные почвы удобряли фос- форно-калийными удобрениями по 60 кг/га . и КаО.

В условиях вегетационных опытов штамм Р 99 при инокуляции повысил урожай абсолютно сухой массы клевера на 25% по сравнению с производственными штаммами. Аналогичные результаты получены и в полевых опытах, где новый штамм дал прибавку урожая абсолютно сухой массы на 6,8 ц/га, с тем как производственные штаммы дают от 3,1 до 5,4 ц/га (табл.1).

Инокуляция не имела существенного значения на процентное содержание сырого белка в урожае. Тем не менее, при положительном действии инокуля- ции нового штамма на урожай общий сбор сырого белка при этом значительно превышал уровень контрольных и инокулированных производственными

штаммами растений: прибавка сырого белка составила 1,5 ц/га по сравнению с неинокулированными растениями. В то же время производственные штаммы

г

0

$ 5

0

0

5

5

способствовали прибавке белка в среднем на 0,4- ц/га.

Следует отметить, что штамм Р 99 , образовывал на корнях несколько меньше клубеньков (227 единиц на одном рас- стоянии), чем более вирулентный производственный штамм 348а, но превысил другой производственный штамм 3296.

Пример 1. Жидкую культуру клубеньковых бактерий выращивают в питательной среде следующего состава, %: кукурузный экстракт 1,0; (NH4)Z 0 0,05; сахар 1,0; КгНР04- 0,05; MgS04.. 7K40 0,02; NaCl 0,02; мел 0,1.

Стерилизация - 1,0 атм, 30 мин, рН после стерилизации 7,0.

Культуру разводят охлажденной стерильной водой и смешивают с нейтрализованным нестерильным торфом из расчета 1,0 г препарата - 0,7- - 1,0 млрд. клеток бактерий при влажности 50%.

Для улучшения условий роста и выживаемости клубеньковых бактерий в торф вносят мелассу в количестве 6% от веса сухого торфа. Препарат помещают в специальные кюветы по 10-15 кг или в пакеты по 1,0 кг и выдерживают в течение 5 сут при 20°С. Затем препарат перемещают и расфасовывают по 200-1000 г в пакетах полиэтиленовой пленки толщиною 40-80 мк, которые запаивают и хранят при 5йС.

В течение 12 мес титр клеток клубеньковых бактерий составил 2,5 млрд/г препарата.

П р и м е р 2. Инокуляцию стерильного торфа проводят инъекцией культу- ральной жидкости непосредственно в пакет. Торф влажностью 30% с добавкой мела расфасовывают в пакеты по 0,16; 0,33 и 0,80 кг (из расчета по- лучения 1,2 и 5 га/порций препарата) при коэффициенте заполнения 0,5-0,7. Пакеты запаивают; упаковывают в картонные коробки и стерилизуют гамма- лучами (2,5 Мрад). Стерильный торф инокулируют иньекцией жидкой культуры непосредственно в пакет. Инокулюм вносят из расчета 1,2 млрд/г бактерий при 60% влажности препарата. Отверстие от укола заклеивают клейкой лентой. В качестве питательной добавки при производстве препарата вносят 6% мелассы от веса сухого торфа. При 12 мес хранения ризоторфина титр сохраняется в среднем 4,5 млрд клеток/г препарата.

5 1

При изучении эффективности штаммов клубеньковых бактерий используют торфяные препараты этих бактерий в виде ризоторфина: Проводят инокуляцию семян лугового клевера с исходным титром 450x10 клеток на гектар- ное количество семян или 50x10 клеток на одно семя.

В табл.2 показано влияние инокуляции лугового клевера различными штаммами Rhizobium trifolii в полевых опытах.

553206

Как видно из табл.2, в этой.серии полевых опытов штамм Р-99 также показал хорошие результаты. По эффективности он превысил штамм 3326 на 5 2,6 ц/га урожай абсолютно сухой массы или на 6,8 ц/га по сравнению с контролем.

10 Формула изобретения

1 Штамм бактерий Rhizobium trifolii ВНИИСХМ-1360, используемый для получения нитрагина под клевер луговой.

„- - , f

Таблица 1

Таблица2