СПОСОБ ОТБОРА ЭФФЕКТИВНЫХ ШТАММОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ Rhizobium loti L., СПОСОБНЫХ К ЭФФЕКТИВНОМУ СИМБИОЗУ С ЛЯДВЕНЦЕМ РОГАТЫМ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12R1/41 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к приемам возделывания лядвенца рогатого, и может быть использовано в селекции растений для создания исходного материала (сорто-микробных систем с повышенной азотфиксирующей способностью) и повышения продуктивности лядвенца рогатого.

Эта культура имеет большое значение как устойчивый бобовый компонент на малопродуктивных почвах Нечерноземной зоны России. Лядвенец рогатый представляет огромный интерес для засушливых районов и для почв с повышенной кислотностью. Данный вид характеризуется высокой общей и белковой продуктивностью, имеет хорошее соотношение незаменимых аминокислот, является мощным биологическим азотфиксатором. Такие хозяйственно-биологические особенности лядвенца рогатого говорят о ценности этой культуры как в плане получения полноценного корма, так и в его пользе для повышения плодородия почвы.

Известно, что для осуществления активной азотфиксации в почве должны присутствовать эффективные штаммы клубеньковых бактерий, специфичные для конкретной бобовой культуры, в данном случае лядвенца рогатого. Наличие таких штаммов определяет наиболее полную реализацию потенциальных возможностей бобовых. В настоящее время производственные эффективные штаммы Rhizobium loti L. фактически отсутствуют.

Исследования по изучению азотфиксирующей способности лядвенца рогатого в нашей стране практически не ведутся, соответственно нет и методик отбора и оценки эффективных штаммов клубеньковых бактерий Rh. loti L.

Во ВНИИ кормов ранее был разработан способ отбора штаммов Rh. trifolii, способных к эффективному симбиозу на кислых почвах с повышенным содержанием ионов алюминия, включающий оценку жизнеспособности штаммов, инокулированных на бобовые растения, выращивание их на безазотистой питательной среде с повышенной кислотностью, отличающийся тем, что культивируют штаммы бактерий Rh. trifolii в течение 3-х суток на селективной бобовой питательной среде, содержащей ионы Al³⁺, внесенного после стерилизации среды в форме AlCl₃ в количестве 75 мг/л (до достижения pH среды 4,5), затем оценивают и отбирают эффективные кислотоустойчивые штаммы, далее проводят выращивание отобранных штаммов на безазотистой питательной среде Красильникова-Кореняко, содержащей ионы Al³⁺, внесенного в форме AlCl₃ в количестве 50 мг/л (до достижения pH среды 4,5), путем посева проростков клевера с одновременной инокуляцией их данными штаммами, после чего растения клевера выращивают в условиях искусственного климата с рекомендуемым режимом, а через 30-35 дней после посева (на ранних этапах онтогенеза клевера) отбирают штаммы, способные к эффективному симбиозу на кислых почвах по накоплению биомассы (1).

Недостатком данного способа является наличие сильно кислой среды в питательном субстрате для выращивания инокулированных бобовых культур, в условиях которого не может проявляться потенциальная эффективность клубеньковых бактерий лядвенца рогатого.

Существует способ отбора клубеньковых бактерий на эффективность симбиоза на ранних стадиях онтогенеза, разработанный во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, успешно используемый для клевера и люцерны, который основан на выращивании их на безазотистой среде Красильникова-Кореняко. Согласно этой методике эффективность штаммов определяется по накоплению биомассы инокулированными 30-суточными растениями по отношению к неинокулированным, при этом прибавка должна составлять не менее 60-70% (2).

Недостатком данного способа является то, что он не пригоден для лядвенца рогатого, так как при выращивании данного вида бобовых в безазотистой среде у 30-суточных растений не происходит накопления достаточной биомассы для проведения достоверной оценки испытуемых штаммов.

Цель изобретения - разработка способа отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий лядвенца рогатого на ранних стадиях онтогенеза.

Поставленная цель достигается разработкой способа отбора штаммов клубеньковых бактерий Rhizobium loti L., способных к эффективному симбиозу с лядвенцем рогатым, включающего оценку эффективности штаммов на ранних стадиях онтогенеза при выращивании растений на питательной среде Красильникова-Кореняко путем высадки проростков с одновременной инокуляцией их штаммами клубеньковых бактерий. В питательную среду вносится минеральный азот в дозе 0,072 г/л - 0,3 от полной нормы азота по Прянишникову, составляющей 0,240 г/л (3), по истечении 45-50 дней после посева производят оценку симбиотической эффективности лядвенца рогатого с штаммами бактерий Rhizobium loti L. по накоплению биомассы, с последующим отбором эффективных штаммов клубеньковых бактерий Rhizobium loti L.

Проведенные предварительные опыты показали, что методика, применяемая на клевере и люцерне, предусматривающая выращивание растений на безазотистой среде, для лядвенца рогатого оказалась не пригодной, так как эффективность симбиоза проявлялась лишь на 55-ый день с момента появления всходов (табл. 1). Это связано, в первую очередь, с тем, что к началу активного функционирования симбиотического аппарата лядвенца рогатого (на 45 день от появления всходов) наблюдалась полная остановка роста и развития неинокулированных растений и, как следствие, снижение точности отбора эффективных штаммов. Проведенные исследования выявили существенное увеличение продолжительности опыта на безазотистой среде (почти в 2 раза).

Для более достоверной оценки и отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий лядвенца рогатого на начальном этапе онтогенеза требовалась стартовая доза минерального азота для ускорения развития и продления жизнедеятельности контрольных (неинокулированных) растений.

Начальный этап исследований заключался в определении оптимальной нормы азота и срока оценки активности симбиотической системы растений.

В качестве объекта исследований был использован районированный сорт Луч селекции ВНИИ кормов. Инокуляцию семян проводили штаммом Rh. loti №1802, полученным из ВНИИСХ микробиологии. Эффективность азотфиксации определяли в динамике роста и развития растений по накоплению сухой биомассы.

Пробирки с субстратом и питательным раствором перед посевом стерилизовались при 1,1 атмосфере в течение 45 мин, семена перед проращиванием обрабатывались концентрированной серной кислотой в течение 5 мин. Выращивание растений проводилось в камере искусственного климата при освещенности 16000 люкс, фотопериоде 16 часов, дневной температуре 20-25°С и ночной - 16-18°С. Затем через 45-50 дней после посева отбирались штаммы, способные к эффективному симбиозу с лядвенцем рогатым, которые обеспечивали накопление биомассы инокулированных растений по сравнению с контролем (неинокулированные растения) не менее чем на 60-70%. На фигуре 1 показано влияние инокуляции на динамику формирования клубеньков лядвенца рогатого.

Изучение формирования симбиотической системы лядвенца рогатого в динамике роста и развития растений показало, что полноценный симбиотический аппарат образуется к 45 дню после появления всходов растений. К этому моменту клубеньки приобретают характерную для фиксации молекулярного азота окраску (желто-розовую) и практически прекращается их количественный прирост (фиг. 1). В последующем количество клубеньков на растении остается почти на одном уровне.

Для определения оптимальной нормы минерального азота с целью оценки эффективности клубеньковых бактерий был заложен микровегетационный опыт со следующими фонами: 0,0 г/л; 0,048 г/л; 0,072 г/л и 0,096 г/л азота по Прянишникову, экспериментальные данные которого представлены в табл. 1.

Из таблицы видно, что к 45 дню опыта на безазотистой среде рост и развитие растений лядвенца рогатого прекратился, на фоне азота 0,048 г/л прирост составил 57%, а на 0,096 г/л - 48%. Максимальная прибавка биомассы получена при норме азота 0,072 г/л, которая в процентном выражении составила 68% над контролем. Такое преимущество как раз и говорит об оптимальности данной нормы азота при проведении оценки и отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий изучаемой культуры.

На основе разработанного способа была проведена оценка и отбор эффективных штаммов клубеньковых бактерий, выделенных из аборигенной почвенной микрофлоры. Из ряда выделенных штаммов высокой эффективностью обладали 3 штамма, которые в дальнейшем были оценены в вегетационном опыте в почвенной культуре.

В качестве экспериментального материала использовали районированный сорт Луч, перспективные номера СГП-3 и СГП-6 и специфичные для лядвенца рогатого штаммы клубеньковых бактерий, выделенные из местной почвенной микрофлоры Лц-1, Лц-2 и Лц-3, а также производственный штамм №1802. За контроль принимали растения без дополнительной инокуляции. Результаты полученных исследований приведены в таблице 2.

Специфическое действие штаммов клубеньковых бактерий обусловило неодинаковое их влияние на накопление биомассы сорта Луч и испытываемых сортообразцов.

Среди изучаемых штаммов на сорте Луч эффективным оказался штамм Л_ц-1. В результате обработки этим штаммом семян лядвенца рогатого абсолютно сухая биомасса сорта составила 3,46 г/растение (на 8% выше контроля), в том числе абсолютно сухая масса корней - 0,91 г/растение (на 19% выше контроля). Для сортообразца СГП-3 лучшим оказался штамм Л_ц-2. При обработке этим штаммом абсолютно сухая биомасса сортообразца составила 3,73 г/растение, что на 25% превышает контроль, при этом сухая масса корней составила 0,96 г/растение - на 28% выше контроля.

При изучении этих же штаммов на сортообразце СГП-6 наибольшее влияние на формирование биомассы оказал коммерческий штамм №1802. Абсолютно сухая биомасса в этом варианте составила 3,24 г/раст., которая выше контроля на 23%, а абсолютно сухая масса корней - 0,81 г/раст., что на 11% превышает контроль.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить достоверную оценку и отбор эффективных штаммов клубеньковых бактерий лядвенца рогатого на ранних этапах роста и развития растений. Выращивание растений следует проводить в условиях микровегетационного опыта на питательной среде Красильникова-Кореняко с добавлением 0,072 г/л азота, а оценку штаммов - через 45-50 дней после всходов растений. Производственное применение таких штаммов повышает кормовую, белковую продуктивность и массу корней лядвенца рогатого за счет увеличения эффективности симбиотической азотфиксации, что положительно сказывается на улучшении плодородия почвы.

Источники информации

1. Патент №2205215, РФ МПК C12N 1/20, А01С 21/00 C12Q 1/02 // (С 12 1/02 C12R 1:41) / Способ отбора штаммов Rh. trifolii, способных к эффективному симбиозу на кислых почвах с повышенным содержанием ионов алюминия. / Л.В. Дробышева, Г.П. Зятчина, И.Е. Огаркова (РФ). - №2205215; заявлено от 16.02. 2000 г.; опубликовано 27.05.2003; Бюл. №15.

2. Методические рекомендации по получению новых штаммов клубеньковых бактерий и оценке их эффективности. ВНИИСХМ, Л., 1979, с. 16-18.

3. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. Киев, 1973, с. 31.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции растений для повышения продуктивности лядвенца рогатого. Способ предусматривает выращивание лядвенца рогатого на питательной среде Красильникова-Кореняко, в которую добавляют минеральный азот в дозе 0,072 г/л. Одновременно с высадкой проростков лядвенца рогатого проводится инокуляция их штаммами клубеньковых бактерий. По истечении 45-50 дней после посева производят оценку симбиотической эффективности лядвенца рогатого со штаммами бактерий Rhizobium loti L. по накоплению биомассы с последующим отбором эффективных клубеньковых бактерий Rhizobium loti L. Изобретение позволяет повысить выход биомассы растений лядвенца рогатого. 1 ил., 2 табл.

Способ отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий Rhizobium loti L., способных к эффективному симбиозу с лядвенцем рогатым на ранних стадиях онтогенеза, включающий выращивание лядвенца рогатого на питательной среде Красильникова-Кореняко с добавлением минерального азота в дозе 0,072 г/л и с одновременной инокуляцией проростков штаммами бактерий Rhizobium loti L., по истечении 45-50 дней после посева производят оценку симбиотической эффективности лядвенца рогатого с штаммами бактерий Rhizobium loti L. по накоплению биомассы с последующим отбором эффективных штаммов клубеньковых бактерий Rhizobium loti L.