СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ СОДЕРЖАНИЯ САХАРОВ В АГАРИЗОВАННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ МЕТОДОМ ВЭЖХ НА АМИНОФАЗЕ Российский патент 2003 года по МПК G01N1/36 G01N1/28 C07H1/06 

Изобретение относится к области аналитической химии, может использоваться в биотехнологии для определения поглощения сахаров при росте каллусных культур и касается способа пробоподготовки при определении содержания сахаров в агаризованных питательных средах.

При определении сахаров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на привитой аминофазе с использованием в качестве элюентов 65-80%-ных растворов ацетонитрила в воде требуется количественная экстракция (растворение) твердого образца в растворителе, близком по составу к используемому элюенту, и фильтрация экстракта для удаления механических примесей.

Известен способ подготовки раствора пробы (прототип), в котором исследуемый образец измельчается и растворяется в элюенте, а нерастворимые примеси отфильтровываются через фильтр с порами 0,2-0,5 мкм (Стыскин Е.Л., Ициксон Л. Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. - М.: Химия, 1986. - С.251).

Недостатком данного способа пробоподготовки при определении сахаров в агаризованных питательных средах является неполная экстракция и растворение сахаров в результате того, что отбухание сред при их обработке 60-80%-ным водным ацетонитрилом протекает медленно, не до конца и не приводит к высокому измельчению сред даже при интенсивном перемешивании в гомогенизаторе и использовании ультразвука. Неполная экстракция сахаров из агаризованных сред приводит к занижению результатов определений.

Техническим результатом изобретения является увеличение скорости отбухания агаризованных сред и степени их измельчения при пробоподготовке, ведущее к росту степени экстракции сахаров из агаризованных питательных сред, и увеличение точности определения их содержания.

Техническим результат достигается тем, что в способе подготовки пробы при определении содержания сахаров в агаризованных питательных средах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на аминофазе, включающий экстракцию сахаров в присутствии ацетонитрила и фильтрацию экстракта, согласно изобретению образец среды предварительно расплавляют, затем обрабатывают 100%-ным ацетонитрилом при объемном соотношении среды и ацетонитрила 1 : 7 при интенсивном перемешивании в течение 2-5 мин и проводят экстракцию сахаров путем добавления воды при объемном соотношении среды и воды 1:3-4. Образец среды расплавляют при 50^oС. Экстракцию проводят в течение не менее 10 мин. При этом исключается растворение агара, что способствует более полному растворению сахаров при последующей экстракции.

Способ осуществляется следующим образом: агаризованную среду (ρ=1,02-1,04 г/см³) взвешивают и расплавляют в колбе при 50^oС. При интенсивном перемешивании на магнитной мешалке к ней добавляют 100%-ный ацетонитрил при соотношении среды и ацетонитрила 1 : 7 (по объему). Для полного отбухания агара суспензию перемешивают в течение 2-5 мин. Экстракцию сахаров из хлопьев твердого агара ведут в течение 10 мин после добавления в суспензию воды при соотношения среды и вода 1:3-4 (по объему). При этом достигается такое соотношение ацетонитрила и воды в экстрагенте (64-70%), при котором исключается растворение агара, мешающего определению сахаров. Для получения пробы сахаров экстракт отделяют от хлопьев агара путем фильтрования через фильтр с порами 0,2-0,5 мкм.

Пример 1. Для агаризованных сред, содержащих моносахариды (арабиноза, галактоза, глюкоза): 5 г среды (около 5 см³) расплавляют в колбе при 50^oС, при перемешивании на магнитной мешалке в колбу приливают 35 см³ ацетонитрила и через 2-5 мин 15 см³ воды для достижения соотношения ацетонитрил - вода в экстрагенте 70-30%. Перемешивание продолжают еще около 10 мин, после чего хлопья агара отделяют фильтрованием через фильтр с порами 0,2-0,5 мкм, определяют точный объем фильтрата и анализируют его методом ВЭЖХ на аминофазе.

Пример 2. Для агаризованных сред, содержащих дисахариды (сахароза): порядок действий по примеру 1 с добавлением 20 см³ воды вместо 15 см³ для достижения соотношения ацетонитрил - вода в экстрагенте 64-36%.

Сравнительные результаты определений приведены в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно увеличить точность определения содержания сахаров в агаризованных питательных средах вследствие увеличения скорости отбухания сред и степени их измельчения, ведущих к увеличению степени экстракции сахаров при пробоподготовке.

Изобретение относится к области аналитической химии, может использоваться в биотехнологии для определения поглощения сахаров при росте каллусных культур и касается способа пробоподготовки при определении содержания сахаров в агаризованных питательных средах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на аминофазе. В способе образец агаризованной питательной среды предварительно расплавляют при 50^oС и обрабатывают при интенсивном перемешивании 100%-ным ацетонитрилом до образования мелких хлопьев агара, которые в дальнейшем экстрагируют путем добавления воды до содержания ацетонитрила в экстрагенте 64-70 об. %. Изобретение позволяет увеличить скорость отбухания агаризованных сред и степень их измельчения при пробоподготовке, что ведет к росту степени экстракции сахаров и увеличению точности определения их содержания. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ подготовки пробы при определении содержания сахаров в агаризованных питательных средах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на аминофазе, включающий экстракцию сахаров в присутствии ацетонитрила и фильтрацию экстракта, отличающийся тем, что образец среды предварительно расплавляют, затем обрабатывают 100%-ным ацетонитрилом при объемном соотношении среды и ацетонитрила 1 : 7 при интенсивном перемешивании в течение 2-5 мин и проводят экстракцию сахаров путем добавления воды при объемном соотношении среды и воды 1: 3-4. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец среды расплавляют при 50^oС. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию проводят в течение не менее 10 мин.