ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ SILENE VULGARIS (MOENCH) GARCKE Российский патент 2001 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей и может быть использовано в медицинской промышленности.

Питательные среды для получения каллусной ткани Silene vulgaris (Moench) Garcke из литературных источников нами не выявлены. Наиболее близкой к заявленному изобретению является питательная среда для получения каллусной ткани бегонии краснолистной (RU патент 1664841, мки С 12 N 5/04) следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: пиридоксин 0,1; тиамин 0,1; никотиновая кислота 0,5; инозитол 40; сахароза 3%; 6-БАП 1 мг/л; 2,4-Д 1 мг/л.

Задачей настоящего изобретения является определение состава питательной среды для получения каллусной ткани Silene vulgaris, которая способствует эффективному каллусообразованию за короткий срок культивирования.

В этом состоит новый технический результат, находящийся в причинно-следственной связи с существенными признаками изобретения.

Технический результат достигается тем, что стерильные экспланты прикорневые почки Silene vulgaris (М.) G. помещаются на агаризованную модифицированную питательную среду следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: фолиевая кислота 0,5; рибофлавин 0,5; биотин 1,0; Ca-пантотенат 1,0; пиридоксин 1,0; тиамин хлорид 1,0; никотинамид 2,0; кобаламин 0,0015; кинетин 1,5 мг/л или 6-БАП 0,5 мг/л; 2,4-Д 1,5-2,0 мг/л; сахароза 1,5%; глюкоза 1,5%; бакто-агар 8000 мг/л, с последующей инкубацией при 26±1^oC в условиях непрерывной темноты.

Для приготовления питательной среды используют химически чистые реактивы (хч, чда). Готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП, 2,4-Д, сахарозу, глюкозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 250 мл насыпают по 2 г бакто-агара, разливают среду по 250 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 10 мин при 1 атм. Чашки Петри стерилизуют в сухожаровом шкафу при 180^oC, завернутые в бумагу Крафт. В стерильном боксе в чашки Петри разливают по 30 мл питательной среды.

В качестве эксплантов используют прикорневые почки, которые показали в ходе изучения каллусообразования эксплантов различного происхождения высокую эффективность (82%). Стерилизацию эксплантов проводят путем обработки 70%-ным этанолом (10-15 сек), затем 5%-ным раствором гипохлорита натрия в течение 10 мин с последующим 3-кратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Индукцию каллуса прикорневых почек проводят на модифицированной питательной среде следующего состава, мг/л:
Макросоли:
KNO₃ - 1900
NH₄N0₃ - 1650
CaCl₂ - 332
MgSO₄•7H₂O - 370
KH₂PO₄ - 170
Микросоли:
FeSO₄ • 7H₂O - 27,85
Na₂ЭДTA - 37,25
H₃ВО₃ - 6,2
MnSO₄ • 5H₂O - 24,1
ZnSO₄ • 7H₂O - 8,6
Na₂MoO₄ - 0,25
Kl - 0,83
CuSO₄ • 5H₂O - 0,025
CoCl₂ • 6H₂) - 0,025
Витамины:
Фолиевая кислота - 0,5
Рибофлавин - 0,5
Биотин - 1,0
Ca-пантотенат - 1,0
Пиридоксин - 1,0
Тиамин хлорид - 1,0
Никотинамид - 2,0
Кобаламин - 0,0015
Кинетин или - 1,5
6-БАП - 0,5
2,4-Д - 1,5-2,0
Сахароза - 15000
Глюкоза - 15000
Бакто-агар - 8000
Вода - до 1 л
Чашки Петри содержат в термостате при 26±1^oC в условиях непрерывной темноты. Спустя 6 дней на эксплантах происходит каллусообразование. Через 4 недели каллусную ткань отделяют от экспланта и пассируют на агаризованную питательную среду для дальнейшего культивирования. Для индуцирования каллусогенеза использовали 8 модификаций питательных сред на основе среды Мурасиге и Скуга.

Результаты исследований представлены в таблице.

Как видно из таблицы частота каллусогенеза высокая на средах 2,3,5,7, 8, на остальных средах ниже. Однако в ряде случаев у первичных каллусов появляются признаки корневой и стеблевой дифференциации. Самая высокая частота морфогенеза имеет место на средах 2 и 6. На средах 3, 5, 7 образуется плотный со слабым ростом каллус, клетки которого быстро приобретают бурую окраску и погибают. На средах 1, 2, 4 образуется рыхлый, оводненный каллус. Присутствие кинетина в среде (среды 6 и 8) также способствует формированию рыхлого, оводненного каллуса.

Наиболее благоприятными для получения каллусной ткани Silene vulgaris (М. ) G. являются сочетания фитогормонов кинетин (1,5 мг/л) + 2,4-Д (2,0 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л) + 2,4-Д (1,5 мг/л). Применение предлагаемого состава среды позволяет индуцировать каллусогенез за короткий срок - 6 дней с высокой эффективностью каллусообразования эксплантами (82% и 67% соответственно) и низкой частотой морфогенеза (9% и 11% соответственно). Кроме того, отмечаются хорошие качественные характеристики первичного каллуса - рыхлость и оводненность.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей, и может быть использовано в медицинской промышленности. Стерильные экспланты - прикорневые почки Silene vulgaris (Moench) Garcke помещают на агаризованную модифицированную питательную среду следующего состава: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: фолиевая кислота 0,5; рибофлавин 0,5; биотин 1,0; Са-пантотенат 1,0; пиридоксин 1,0; тиамин хлорид 1,0; никотинамид 2,0; кобаламин 0,0015; кинетин 1,5 мг/л или 6-БАП 0,5 мг/л; 2,4-Д 1,5-2,0 мг/л; сахароза 1,5%; глюкоза 1,5%; агар 8000 мг/л, вода до 1 л с последующей инкубацией при 26±1°С в условиях непрерывной темноты. Каллусогенез индуцирован за 6 дней с высокой эффективностью каллусообразования эксплантами и низкой частотой морфогенеза. Повышаются качественные характеристики первичного каллуса - рыхлость и оводненность. 1 табл.

Питательная среда для получения каллусной ткани Silene vulgaris (Moench) Garcke, характеризующаяся тем, что содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:
КNО₃ - 1900
NН₄NО₃ - 1650
СаСl₂ - 332
МgSО₄•7Н₂О - 370
КН₂РО₄ - 170
FeSO₄•7Н₂О - 27,85
Nа₂ЭДТА - 37,25
Н₃ВО₃ - 6,2
MnSО₄•5Н₂О - 24,1
ZnSO₄•7Н₂О - 8,6
Nа₂МоО₄ - 0,25
КI - 0,83
CuSO₄•5Н₂О - 0,025
СоСl₂•6Н₂О - 0,025
Фолиевая кислота - 0,5
Рибофлавин - 0,5
Биотин - 1,0
Са-пантотенат - 1,0
Пиридоксин - 1,0
Тиамин хлорид - 1,0
Никотинамид - 2,0
Кобаламин - 0,0015
Кинетин или - 1,5
6-БАП - 0,5
2,4-Д - 1,5 - 2,0
Сахароза - 15000
Глюкоза - 15000
Агар - 8000
Вода - До 1 лв