ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS EXTREMIORIENTALIS - ПРОДУЦЕНТ ВИСКОЗИНОПОДОБНОГО ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОГО ПЕПТИДА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12P21/04 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к штамму бактерий Pseudomonas extremiorientalis - продуценту вискозиноподобного пептида, обладающего поверхностно-активными свойствами, который может найти применение в пищевой, косметической, нефтедобывающей промышленности, в биоочистке от загрязнений почвы и воды.

Микроорганизмы синтезируют много потенциально важных биосурфактантов (БС). Наиболее эффективными среди них являются липопептиды такие, как сурфактин, полимиксин и грамицидин S. Возрастающий интерес к микробиальным БС диктуется широким спектром их свойств, а также их полной утилизацией по сравнению с синтетическими. Актуальность исследований вискозиноподобных соединений определяется также их значительным ингибирующим эффектом против Mycobacterium tuberculosis, aviumintracellulare [J, Nat. Prod. 1997. v. 60. p. 223-229] и патогенных растительных грибов [J.Appl.Microbiol. 1999. V. 86. р. 80-90].

Известен штамм Pseudomonas reactans NCPPB 387, выделенный из ассоциативного микробиального сообщества грибов и продуцирующий вещество пептидной природы с поверхностно-активными свойствами. [Tetrahedron. 1991, v. 47, р. 3645-3654].

Задача изобретения - расширение арсенала штаммов бактерий - продуцентов пептидов, обладающих поверхностно-активными свойствами.

Поставленная задача решена новым штаммом бактерий Pseudomonas extremiorientalis, продуцирующим вискозиноподобный поверхностно-активный пептид.

Штамм выделен из питьевой воды природного резервуара (Богатинское водохранилище, Приморский край) методом прямого высева на триптиказный соевый агар следующего состава (г/л): триптиказный соевый пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 2,0; NaCl - 5,0; агар-агар - 15,0; вода дистиллированная - 1000 мл, рН - 7,0. Культуру хранят в пробирках под слоем минерального масла на полужидкой среде приведенного выше состава при температуре 10^oС и в 30% растворе глицерина при температуре -80^oС.

Штамм хранится в Коллекции морских микроорганизмов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН под номером КММ 3447, он депонирован в Бельгийской коллекции микроорганизмов под номером LMG 19695.

Штамм Pseudomonas extremiorientalis имеет следующие характеристики.

Культурально морфологические признаки.

Штамм КММ 3447 образует на агаризованных средах круглые (4-6 мм), выпуклые, слизистые молочно-белые колонии. Клетки представляют собой небольшие подвижные (0,5-0,9х1,5х2,5 мкм) грамотрицательные палочки, имеющие аэробный тип метаболизма, способные расти при температуре от 10^oС до 35^oС.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм КММ 3447 оксидазоположителен, характеризуется отсутствием ДНКазы, уреазы, гидролизует желатин, крахмал, казеин, твин-85; не продуцирует сероводород, индол, ацетон. Ассимилирует D-галактозу, D-арабинозу, D-рибозу, мальтозу, глицерин, сахарозу, ксилозу, D-глюкозу. Слабо ассимилирует цитрат. Не усваивает сорбозу, мелибиозу, лактозу, инозит, маннит, дульцит, адонит, рамнозу.

Хемотаксономические признаки.

Основные жирные кислоты представлены 16:1(n-7)(30%), 16:0(15,5%), 18: l(n-7) (13,1%).

На основании физиолого-биохимических и хемотаксономических признаков штамм КММ 3447 отнесен к бактериям рода Pseudomonas.

Молекулярно-генетические признаки.

Состав Г+Ц оснований в ДНК составляет 61,0 mol%.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК гена выявил 99,6-99,8% гомологии с 16S рРНК генами Р. orientalis, P. tolaassii, P. rhodesiae, Р. veronii.

Эксперименты по ДНК-ДНК гибридизации штамма КММ 3447 с филогенетически близкими типовыми штаммами показали 61,7% гомологии со штаммом Р. rhodesiae CIP 104664^T, 45% с Р. orientalis CIP 105540^T 53% с Р. tolaassii LMG 2342^T и 27% с Р. veronii CIP W4663^T, что позволило идентифицировать штамм 3447 как новый вид (Int. J. Syst. Bacteriol, 1987, 37, р. 463-464), Pseudomonas extremiorientalis.

Культивирование штамма 3447 проводят на среде TSA следующего состава (г/л): триптиказный соевый пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 2,0; NaCl - 5,0; вода дистиллированная - 1000 мл, рН - 7,0. Посевной материал Pseudomonas extremiorientalis KMM 3447 выращивают в колбах емкостью 100 мл, содержащих 50 мл ферментационной среды, в течение 20-24 часов при температуре 23-25^oС на качалке со скоростью вращения 150 об/мин, до получения плотности 10⁹ клеток/мл. Полученным посевным материалом засевают колбы емкостью 1000 мл, содержащие 500 мл ферментационной среды того же состава. Ферментацию проводят в течение 24 часов при температуре 25^oС на качалке со скоростью вращения 120 об/мин.

Пример использования штамма бактерии Pseudomonas extremiorientalis KMM 3447 для получения вискозиноподобного биосурфактанта.

Из культуральной жидкости (3 л) клетки удаляют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 15^oС). Полученный супернатант экстрагируют бутанолом (1 лх3). Бутанольный экстракт упаривают при пониженном давлении досуха, и остаток перераспределяют между водой и гексаном, водой и хлороформом. Концентрированную хлороформенную фракцию хроматографируют на колонке с силикагелем в градиентной системе этилацетат-этанол (9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 4:1, 3:1. 1:1). Объединенную поверхностно-активную фракцию (4:1, 3:1) упаривают и перераспределяют между водой и хлороформ-этанолом 3:1 с последующей кристаллизации из этанола. Из 1 л культуральной жидкости получают 75 мг пептида.

Характеристики пептида: [М+Н]⁺=1126; аминокислотный состав: Thr, 2Ser, Glu, Val, Ile, 3Leu. Данные ¹Н- и ¹³С ЯМР-спектров наряду с ИК-спектроскопией выделенного соединения совпадают с описанным в литературе вискозином (Tetrahedron. 1991, v. 47, р.3645-3654).

Вискозиноподобный пептид, продуцируемый штаммом бактерий Pseudomonas extremiorientalis, обладает поверхностно-активными свойствами.

В качестве образца сравнения взят сурфактин с молекулярным весом 1035, имеющий C₁₅-iso-жирно-кислотный фрагмент (Изв. Акад. Наук. Сер. хим. 1995, 5, с.979-983). Вискозиноподобное соединение снижает поверхностное натяжение воды от 72 до 32 mN/m (образец сравнения снижает его до 31 mN/m). Определение активности по методу разрыва нефтяной пленки на поверхности дистиллированной воды (J. Bacteriol., 1993, v. 175, 20, р.6459-6466) показало, что выделенный из штамма Pseudomonas extremiorientalis пептид на одну треть активнее, чем образец сравнения.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Pseudomonas extremiorientalis - продуцент виксозиноподобного пептида, обладающего поверхностно-активными свойствами, который может найти применение в пищевой, косметической, нефтедобывающей промышленности, в биоочистке от загрязнений почвы и воды. Штамм выделен из питьевой воды природного резервуара (Богатинское водохранилище, Приморский край) методом прямого высева на триптиказный соевый агар. Штамм хранится в Коллекции морских микроорганизмов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН под номером КММ 3447, он депонирован в Бельгийской коллекции микроорганизмов под номером LMG 19695. Эксперименты по ДНК-ДНК гибридизации штамма КММ 3447 с филогенетически близкими типовыми штаммами позволили идентифицировать штамм 3447 как новый вид Pseudomonas extremiorientalis. Вискозиноподобный пептид, продуцируемый штаммом бактерий Pseudomonas extremiorientalis обладает поверхностно-активными свойствами и, являясь биосурфактантом, позволяет более эффективно проводить биоочистку от загрязнений почвы и воды, не накапливаясь в окружающей среде за счет их полной утилизации путем микробного разложения по сравнению с синтетическими поверхностно-активными веществами.

Штамм бактерий Pseudomonas extremiorientalis (в КММ ТИБОХ 3447 и в ВССМ/LMG Bacteria Collection LMG 19695) - продуцент вискозиноподобного поверхностно-активного пептида.