СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/48 G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, а именно неврологии, нейрохирургии, и может быть использовано как метод скрининга постановки диагноза болезни Альцгеймера при выполнении биопсии головного мозга.

Известен способ диагностики болезни Альцгеймера путем оценки гена, кодирующего аполипопротеин E, напрямую связанного с наличием у пациентов болезни Альцгеймера (R. Mayeux, A.M. Saunders, S.Shea, S.Mirra, D.Evans, A.D. Roses, B. T. Hyman, B.Сrain, M.X.Tang, C.H.Phelps. Utility of the apolipoprotein E genotype in the diagnosis of Alzheimer's disease // New England Journal of Medcine -Vol.338, N 8 - p. 506-511). Способ оценки генотипирования аполипопротеина Е сложен в техническом исполнении и не является достаточно достоверным способом диагностики болезни Альцгеймера.

Известен способ диагностики болезни Альцгеймера путем позитронно-эмиссионной томографии, при котором определяют метаболическую активность клеток различных отделов головного мозга и при выявлении бипариетального и битемпорального снижения регионального мозгового кровотока и снижении метаболизма глюкозы и кислорода диагностируют болезнь Альцгеймера (H. Bergman, Н. Chertkow, С. Wolfson, J. Stern, С. Rush, V.Whitehead, R.Dixon/ HM-PAO (Ceretec) SPECT brain scanning in diagnosis of Alzheimer's disease // Journal of American im Geriatrics Society -1998, Vol. 45, N 1 - p. 15-20). Способ позволяет осуществлять раннюю диагностику заболевания. Данный способ принят за прототип.

Недостатками известного способа диагностики болезни Альцгеймера являются сложность и высокая стоимость выполнения исследования.

Задачей изобретения является создание способа диагностики болезни Альцгеймера, обеспечивающего высокую точность диагностики без использования сложных и дорогостоящих технических средств.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе диагностики болезни Альцгеймера путем исследования головного мозга согласно изобретению исследуют биоптаты теменной, височной и лобной долей коры головного мозга, окрашивают их азотнокислым серебром, в препаратах определяют ядрышки нейронов, в которых отсутствуют аргентофильные гранулы (Аg-гранулы), и при их количестве не менее 20% диагностируют болезнь Альцгеймера.

Интенсивность синтеза белка - важный показатель, характеризующий функциональную активность нервных клеток. В последние годы установлено, что сравнительно простая методика серебрения ядрышкоорганизующих районов хромосом (ЯОР) в интерфазных клетках позволяет оценить уровень транскрипционной активности генов рибосомной РНК (рРНК). Авторами впервые была проведена научная работа, целью которой явилось проверить на клетках нервной системы специфичность выявления ЯОР путем серебрения и установить особенности поражения при болезни Альцгеймера.

Известно, что форма и число ядрышек является важнейшей характеристикой направления и уровня дифференцировки клеток, а также их функционального состояния. В ядрышках в чистом виде представлены гены рибосомной РНК, активность которых может быть оценена в каждой клетке с помощью светового микроскопа после предварительного окрашивания ЯОР нитратом серебра. В основе серебрения ЯОР лежит чрезвычайное сродство к ионам серебра таких важных для транскрипции и созревания прерибосомной РНК ядрышковых протеинов как РНК-полимераза-1, топоизомераза 2-альфа, транскрипционный фактор UBF, нуклеолин. При этом количество Ag-гранул в ядрышках приблизительно соответствует числу активно работающих в них РНК-полимераз-1 (Н.Н. Мамаев. Использование метода серебрения цистронов рибосомной РНК интерфазных клеток для количественной оценки гемопоэза при заболеваниях крови // Метод. рекомендации -СПб - 1998 - 11 с.). Специфичность метода выявления ЯОР путем серебрения в основном проверялась на быстро обновляющихся популяциях клеток, что позволило установить зависимость состояния ядрышка от фазы клеточного цикла. При этом была доказана прямая зависимость числа Ag-гранул от пролиферативного статуса клеток, направления их дифференцировки и степени полиплодизации ядра. Отмечена важная диагностическая и прогностическая значимость данных серебрения ядрышек при многих опухолях человека.

Проведенные авторами исследования показали, что метод выявления ЯОР путем серебрения может быть использован для количественной оценки состояния ядрышкового аппарата клеток нервной ткани. Он обеспечивает высокую контрастность объекта и специфичность, которая позволяет выявить ядрышко без окружающего хроматина. Были установлены особенности поражения ЯОР у больных с болезнью Альцгеймера - не менее чем в 20% ядрышек нейронов коры головного мозга отсутствовали Ag-гранулы.

Способ осуществляют следующим образом.

Приготовленные биоптаты теменной, височной и лобной долей коры головного мозга обезвоживают и заливают в парафин, готовят срезы 10 мкм, размещают их на предметных стеклах. В дальнейшем производят депарафинизацию, фиксируют смесью метиловый спирт - ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1 в течение 10 минут и ополаскивают дистиллированной водой. После высушивания препараты обрабатывают в 2N растворе муравьиной кислоты в течение 20 минут. По окончании инкубации стекла ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и окрашивают 50% раствором нитрата серебра. Для этого на предметное стекло со срезами наносят по 2 капли 2% водного раствора желатина, приготовленного на 1% водном растворе муравьиной кислоты, и 4 капли 50% водного раствора нитрата серебра. Препарат накрывают покровным стеклом и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 минуты. Затем его переносят в камеру с подогретым до 68-70^oC увлажненным воздухом. Анализ препаратов проводят с помощью световой микроскопии при увеличении 1000x. Оценивают количество ядрышек и Ag-гранул, отчетливо выявляющихся в виде черных точек, распределенных внутри ядрышка, в популяции нейронов. У каждого пациента анализируют по 50-100 нейронов, определяют ядрышки нейронов, в которых отсутствуют Ag-гранулы, и при их количестве не менее 20% диагностируют болезнь Альцгеймера.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Больной М. , 63 лет, умер 18.06.1997 года. Смерть пациента наступила на фоне хронической сосудисто-мозговой недостаточности от присоединившейся двусторонней пневмонии. При жизни больной страдал болезнью Альцгеймера, сопровождавшейся общим истощением. При макроскопическом исследовании ЦНС выявлялось: мозговая ткань бледная, кора головного мозга во всех долях мозга истончена. Артерии основания мозга плотные, извитые, на их интиме множественные белесоватые и желтоватые бляшки, сужающие просвет артерий, занимающие 80% интимы. При гистологическом исследовании головного мозга: атеросклероз артерий, гиалиноз артериол, сосуды расширены со стазами, множественные участки с зернистыми шарами, резкая атрофия серого вещества головного мозга. Биоптаты теменной, височной и лобной долей коры головного мозга были окрашены азотнокислым серебром и исследованы. В большинстве ядер нейронов (72,5%) находилось одно крупное ядрышко, в остальных содержалось 2-3 ядрышка. Количество Ag-гранул в ядрышках нейронов было от 0 до 5. Не содержали Ag-гранулы 22,7% ядрышек нейронов.

Использование предлагаемого способа диагностики болезни Альцгеймера обеспечивает высокую точность диагностики без использования сложных и дорогостоящих технических средств.

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, нейрохирургии. Способ обеспечивает высокую точность диагностики без использования сложных и дорогостоящих технических средств. Исследуют биоптаты теменной, височной и лобной долей коры головного мозга, окрашивают их азотнокислым серебром, в препаратах определяют ядрышки нейронов, в которых отсутствуют аргентофильные гранулы (Ag-гранулы), и при их количестве не менее 20% диагностируют болезнь Альцгеймера.

Способ диагностики болезни Альцгеймера путем исследования головного мозга, отличающийся тем, что исследуют биоптаты теменной, височной и лобной долей коры головного мозга, окрашивают их азотнокислым серебром, в пределах определяют ядрышки нейронов, в которых отсутствуют аргентофильные гранулы, и при их количестве не менее 20% диагностируют болезнь Альцгеймера.