Настоящее изобретение относится к косметической композиции, содержащей активное соединение, способное стимулировать in vivo продуцирование интерлейкина-6 (ИЛ-6) кератиноцитами человека.
В широком ряду цитокинов, продуцируемых клетками, особый интерес для использования в косметологии представляет собой специфическое стимулирование синтеза ИЛ-6. Помимо его активирующего действия на клеточный и гуморальный иммунитет ИЛ-6 принимает активное участие в механизмах регенерации эпидермиса. In vitro ИЛ-6 стимулирует синтез коллагена, равно как и пролиферацию кератиноцитов и фибробластов. In vivo у трансгенных мышей со сверхпродукцией ИЛ-6 в коже наблюдается утолщение ороговевшего слоя. Такое увеличение поверхностного слоя эпидермиса происходит без провоспалительного проявления, и предполагается, что оно отражает улучшение в защите кожи против локальных повреждений. Эта совокупность данных, почерпнутых из литературы, указывает на то, что ИЛ-6 способствует восстановлению повреждений, наносимых эпидермису, и замедляет старение кожи.
В качестве ссылок можно привести: К. Yoshisaki et al., Cytokine, 1990, 2, 381-387; R. M. Grossman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6367-6371; Kirbauer et al., J. Immunol., 1989, 142, 1922-1928; К. Turken et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 5068-5072; J. Taylor-Papadimetriou et al., Cell. Differ., 1982, 11, 169-180; L. Arden et al., Limphokines, 1985, 10, 175-182. Хорошо известно, что при старении кожи, во-первых, в эпидермисе ороговевший слой утолщается, но понижается эпидермопоэз и изменяется клеточное сцепление при базальной мембране. Следовательно, для того чтобы защитить кожу от старения, важно обеспечить ее активным агентом, способным стимулировать пролиферацию кератиноцитов с тем, чтобы вызвать утолщение эпидермиса. Во-вторых, в дерме активность клеток, ответственных за конструирование дермальной архитектуры, фибробластов, в значительной мере понижается, следствием чего является уменьшение синтеза коллагена, эластина и гликозаминогликана. Параллельно с этим к ускоренной деградации существующих дермальных волокон приводят эффекты воздействия света (актиническое старение). Эта совокупность эффектов приводит к разупорядочиванию дермальной структуры, которое лишает кожу ее механических свойств, таких как эластичность, прочность и тонус, и тем самым способствует появлению морщин.
Следовательно, для того чтобы противостоять эффектам старения, важно обеспечить кожу активным агентом, который будет стимулировать фибробласты и помогать им восстанавливать их окружение. Чтобы оказаться полезным, этот эффект не должен параллельно сопровождаться увеличением ферментативной активности деградации волокон, в частности активности коллагеназы. Одновременно это не должно изменять естественных функций кожи.
Установлено, что компоненты или экстракты, способные стимулировать продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами человека in vivo, составляют "активные агенты", которые могут быть использованы для приготовления косметических композиций; в частности установлено, что косметические композиции, содержащие соединение, способное стимулировать продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами человека in vivo, может быть использовано для реорганизации ткани кожи, без вмешательства, однако, при этом в ее природные функции. Показано, что соединения с активностью, стимулирующей ИЛ-6 через кератиноциты человека, называемые здесь далее "активными агентами", способны индуцировать воздействие per se на стимуляцию пролиферации кератиноцитов (аутокринное действие ИЛ-6 на кератиноциты, которое описано в литературе).
Кроме того, показано, что соединения с активностью, стимулирующей ИЛ-6 через кератиноциты человека, способны индуцировать посредством их воздействия на фибробласт увеличение тонуса дермального окружения этой клетки. Эти соединения даже индуцируют небольшое увеличение количества коллагеновых волокон без усиления коллагеназной активности.
Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является косметическая композиция, содержащая соединение, которое способно стимулировать продуцирование интерлейкина-6 кератиноцитами человека in vivo, смешанное с косметическим эксципиентом.
Содержащееся в этой косметической композиции соединение с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6, или активный агент, может быть соединением непептидной природы, пептидом, экстрактом клеток или тканей растительного происхождения, либо продуктом, полученным в результате ферментации микроорганизма, например бактерии или гриба и в особенности дрожжей.
Свойства штамма SEBR 2002 будут описаны ниже вместе со способом получения экстракта с активностью, стимулирующей продуцирование интерлейкина-6 кератиноцитами.
Штамм
Выделение
Организмом, который продуцирует экстракты с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами человека, в соответствии с этим конкретным аспектом данного изобретения является штамм дрожжей, выделенный из образца воды с месторождения нефти, взятого с участка нефтяного бурения в Лойрете (Loiret, Франция), которому присвоен внутренний номер SEBR 2002. Образец этого микроорганизма депонирован 11 февраля 1997 года в Национальной коллекции культур микроорганизмов Пастеровского института (C.N.C.M.), где он зарегистрирован под номером I 1844.
Биохимические свойства этого микроорганизма определены на API 50 СН рядах (специфичных для сахаров), которые поставляются BioMerieux, и с помощью YT-биологического теста (специфичного для дрожжей; поставляется Biolog Inc. USA). В результате установлено, что этот микроорганизм принадлежит семейству Basidiomycetes, род Rhodotorula.
Он представляет собой полиморфные мезофильные дрожжи. Он хорошо развивается при 28oС на культуральной среде YPG (дрожжевой пептон-глюкоза-агар); расцветка колоний оранжево-розовая.
Этот организм демонстрирует свойства, которые дают возможность отнести его к виду minuta.
Этот дрожжевой штамм Rhodotorula sp, который депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов (C. N.C.M.) Пастеровского института под номером I 1844, и его мутанты-продуценты также составляют объект настоящего изобретения.
Выделение этого нового штамма осуществлено с использованием традиционного способа, который заключается в разбавлении образца небольшим количеством воды до различных концентраций и рассевании небольшого объема каждого разведения на поверхности чашки Петри, содержащей питательную агаровую среду. После нескольких дней инкубации при 28oС, которые дают возможность микроорганизму развиться, индивидуально отбирают различные колонии и пересевают на питательные агары для получения обогащенных культур.
После культивирования на питательной агаровой среде и нескольких последующих пересевов, которые дают возможность получить обогащенную и чистую культуру представляющего интерес штамма, получают партию 0 исходного штамма и затем партии первичного и вторичного посевов для консервации.
Для этого готовят дрожжевую суспензию, исходя из культуры на питательной агаровой среде на чашках Петри и используя среду для восстановления; эта среда содержит криопротектор для обеспечения хорошей жизнеспособности микроорганизма во время консервации замораживанием.
Полученную дрожжевую суспензию распределяют по криопробиркам, которые консервируют при -80oС: эти пробирки составляет партию 0.
Следуя этому же протоколу, но начиная с пробирки из партии 0, готовят партию первичного посева.
Далее, по-прежнему в соответствии с тем же протоколом, готовят партию вторичного посева, начиная с криопробирки из партии первичного посева.
Получение посевных партий 0, 1 и 2 обеспечивает длительный доступ к штамму и, таким образом, к желаемой активности.
Способ
Способ получения экстрактов с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами человека, заключается в культивировании этого нового штамма I 1844 или его мутантов-продуцентов на подходящей среде и в подходящих условиях культивирования и далее в экстрагировании активной фракции.
Активная фракция может находиться в биомассе или в супернатанте.
Ферментация
Культивирование штамма I 1844 может быть осуществлено любым способом аэробного культивирования. Для этого применяют различные типы оборудования, обычно используемого для промышленной ферментации. В частности для проведения данных процедур может быть выбран приведенный далее подход.
Культивирование в колбах
Используя партию вторичного посева, которой засевают чашки Петри и инкубируют в течение двух-трех дней, получают дрожжевую суспензию, которую используют для засевания встряхиваемых колб Эрленмейера, содержащих подходящую среду. Встряхиваемую колбу также можно непосредственно засеять материалом из пробирки с посевной партией. Культивирование во встряхиваемых колбах может протекать от одного до трех дней.
За продуцированием активности следят посредством экстрагирования органическими растворителями биомассы, полученной фильтрованием или центрифугированием.
Прямо с первой стадии культивирования в колбах выгодным может быть проведение двух последующих стадий культивирования: первой стадии для увеличения числа клеток и наращивания биомассы, второй - для продуцирования. В этом последнем случае для первой стадии достаточной является продолжительность от одного до двух дней.
Активность стимуляции продуцирования ИЛ-6 кератиноцитами человека, которая содержится в экстрактах биомассы культур, выражают в виде индекса или фактора стимуляции, обозначенного как ИСИЛ-6 (ИС), который рассчитывают, составляя отношение количеств ИЛ-6, продуцируемого путем индукции экстрактами, к измеренной базисной величине (без индукции):
Экстракт биомассы считают активным, если при анализе при 1%-ной конечной концентрации относительно сухого экстракта на SVK 14 кератиноцитах он дает величину ИС в интервале от 1,2 до 6, предпочтительно от 1,5 до 4,5.
Из одного литра культуры возможно получение приблизительно от 10 до 50 мл экстракта, имеющего индекс стимуляции между 1,5 и 4,5 для 100-кратного разведения (1/100).
Желаемая активность может быть получена путем экстрагирования биомассы культур в колбах, но для того, чтобы получить желаемую активность в большем количестве, выгодным является получение культуры в ферментаторе и затем экстракция ее биомассы.
Культивирование в ферментаторе
Ферментатор засевают 1-2-дневной культурой из встряхиваемых колб; предпочтительно, чтобы культура еще находилась в экспоненциальной фазе.
В ферментаторе в зависимости от используемых условий культивирования активность можно наблюдать сразу с первых часов культивирования, однако выгоднее дождаться достижения стационарной фазы роста, прежде чем приступать к экстракции. Культивирование I 1844 в ферментаторе делает возможным осуществление лучшего контроля описанных ниже условий культивирования, например контроля рН и аэрации.
Стимулирующая активность через кератиноциты, получаемая в ферментаторе, может изменяться в зависимости от используемых условий культивирования. Из одного литра культуры после экстракции биомассы возможно получение приблизительно 50 мл экстракта со значением ИС между 1,5 и 4,5 для 100-кратного разведения (1/100).
Условия культивирования
Среда для культивирования, используемая в ферментационном способе, должна содержать по меньшей мере один источник углерода, который может быть ассимилирован, один источник азота, который может быть ассимилирован, и минеральные элементы. В качестве источников углерода, которые могут быть ассимилированы, могут быть использованы, например, углеводы, такие как глюкоза, манноза, мальтоза, декстрины, глицерин, аминокислоты и белки.
В качестве источников углерода, которые могут быть ассимилированы, также могут быть использованы уксусная, субериновая, лимонная, пропионовая, янтарная и 2-кетоглутаровая кислоты, либо животные или растительные масла.
Наилучшие источники азота, которые могут быть ассимилированы, следует искать среди белков, пептонов и аминокислот. Эти источники представляют собой, например, казеин, лактальбумин и клейковину, а также их гидролизаты, рыбную муку, дрожжевые экстракты или пептоны.
Продуцирование биомассы может быть увеличено путем добавления во время культивирования одного или другого из этих двух основных субстратов.
Среди минеральных элементов, добавляемых в культуральную среду для обеспечения роста микроорганизма и оптимизации ассимиляции источников углерода и азота клетками микроорганизма, следует упомянуть соли калия, натрия, железа, магния, кальция или марганца, равно как и соединения фосфора, такие как фосфаты, а также микроэлементы.
Культуру перемешивают и аэрируют в течение 10-60 часов, что позволяет получать благоприятные результаты.
Предпочтительно рН культуральной среды поддерживают в слабокислой области, а оптимальная температура инкубации лежит между 23 и 38oС, предпочтительный интервал составляет 25-33oС.
Такие условия культивирования, как состав и рН среды, температура инкубации, скорость перемешивания и аэрация во время ферментации, могут изменяться в широких пределах и выбираются таким образом, чтобы получить наилучшие возможные результаты.
Экстракция
Получение активного экстракта, проявляющего активность, стимулирующую продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами, требует проведения нескольких стадий экстракции.
Первая стадия заключается в отделении биомассы от остатков сусла; для этого можно использовать центрифугирование, тангенциальную микрофильтрацию, фильтрацию во вращающемся барабане или любой другой способ отделения биомассы от ферментационного сусла, традиционно используемый специалистами. Далее биомассу на несколько часов приводят в контакт со смесью растворителей, что позволяет экстрагировать молекулы гидрофобной природы.
Выдерживание в контакте предпочтительно проводят в течение ночи, то есть приблизительно в течение 15 часов.
После этого с помощью фронтальной фильтрации производят разделение биомассы и нагруженной органической фазы и биомассу отбрасывают.
Органическую фазу затем подвергают упариванию под вакуумом в температурном интервале от комнатной температуры до 50oС до получения сухого экстракта.
Получение активного экстракта
Полученный таким образом сухой экстракт может быть переведен в различные растворители, традиционно используемые в косметологии.
Концентрацию в растворителях выбирают так, чтобы обеспечить полное растворение экстракта, и так, чтобы она была совместимой с последующим применением.
Экстракт с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами, переводят в пропорции от 5 до 10% сухого экстракта в зависимости от активности в смесь этанол/вода (50/50; о/о), которая представляет собой предпочтительный растворитель по данному изобретению. В тех случаях, когда желательно получение порошка вместо раствора, сухой экстракт может быть просто высушен вымораживанием.
Анализ активности, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами, проведенный с аликвотной порцией каждого полученного экстракта, дает возможность оценивать их активность и контролировать воспроизводимость способа.
Для удаления каких-либо следов остаточной биомассы и обеспечения микробиологической стабильности экстракта его фильтруют через мембрану с порогом исключения 0,2 мкм и асептически вносят в стерильные колбы. Асептическое приготовление таких растворов позволяет избежать добавления консервантов. Проведение различных биохимических анализов дало возможность продемонстрировать, что экстракты, полученные из этого нового микроорганизма I 1844, обладают очень ценной активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами. Их мощная активность продемонстрирована в различных анализах, которые предсказывают восстановление различных повреждений, нанесенных эпидермису, и замедление старения кожи.
Стимулирующее действие экстракта I 1844 на in vivo синтез ИЛ-6 кератиноцитами человека охарактеризовано, как описано ниже.
Экстракт I 1844 и используемые продукты
Используют различные образцы экстракта I 1844, полученные в схожих условиях из различных ферментационных культур. Образцы хранят при 4oС в смеси этанол/вода (50/50; о/о) в концентрации 0,1 г/г сухого экстракта и затем разводят до конечной концентрации, желательной на момент использования.
Эталонным продуктом для индуцирования синтеза ИЛ-6 является ЛПС (E.coli 055: В5, Sigma), который хранят при -20oС в концентрации 10 мг/мл в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор). Полимиксин В, который является ингибитором ЛПС, получают от Sigma.
Разведение продуктов
Продукты разводят в среде для инкубации кератиноцитов (сравни ниже). Если не оговорено особо, полученные, как указано выше, экстракты I 1844 оценивают при конечной концентрации 1% относительно сухого экстракта. Анализ с ЛПС проводят при его концентрации 10 мкг/мл.
Оценочная модель
Клетки
Используемой линией кератиноцитов человека является линия SVK 14 (J. Taylor-Papadimetriou et al., Cell. Differ., 1982, 11, 169-180), которую поддерживают в культуре в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 100 ммоль пирувата натрия, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ). С целью сравнения на той же среде, что описана выше, но содержащей дополнительно 10 мг/мл EGF (эпидермального фактора роста) и 50 мкг экстракта гипофиза быка, проводят культивирование нормальных лимфоцитов человека (PBMNC), очищенных в градиенте фиколла (Ficoll®) и полученных от здоровых добровольцев, а также кератиноцитов, происходящих от линии А 431 (АТСС CRL 1555), и нормальных кератиноцитов человека, полученных в результате пластической хирургии молочной железы (Biopredic, Rennes).
Инкубация с продуктами
Для индукции ИЛ-6 клетки засевают в трех повторах в конечном объеме 200 мкл при плотности 5•104 клеток на лунку в 96-луночные культуральные микропланшеты. После инкубации в течение 24 часов при 37oС в атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% СO2, среду удаляют и обновляют таким же объемом среды с 1% ФСТ, содержащей продукты в указанных концентрациях. Через последующие 18-24 часа культивирования из каждого из трех повторов удаляют культуральный супернатант, объединяют и замораживают при -20oС до проведения определения содержания цитокинов.
Анализы на цитокины
С помощью наборов для анализов ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) (R&D, Abington, UK) проводят количественную оценку ИЛ-6, ИЛ-1β, ФНОα и ИЛ-8. Оценку каждого супернатанта проводят в двух повторах в соответствии с инструкциями производителя. Предел определения для этих анализов составляет 3 пг/мл. В дополнение к иммунологическому анализу белка с помощью методики ELISA проводят оценку активной формы ИЛ-6 посредством биологического анализа на клетках мышиной гибридомы В9 (L. Aarden et al., Lymphokines, 1985, 10, 175-182).
Выражение результатов
Результаты выражают либо в абсолютных величинах количествa. секретируемых цитокинов (в пг/мл белка для ELISA-анализов или ед/мл для биологического анализа ИЛ-6 на В9, причем одна единица определяется как количество цитокина, которое вызывает эффект пролиферации клеток В9 величиной в 50% от максимального), либо в виде определенного выше индекса стимуляции ИС, который рассчитывают как соотношение между индуцированным продуцированием цитокина и базисным продуцированием:
Результаты
Экстракт с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6, далее здесь будет называться просто "экстракт I 1844". Номер экстракта, использованного в каждом из экспериментов, равно как и его концентрация, указываются.
Действие экстракта I 1844 на стимуляцию кератиноцитного ИЛ-6
Экстракт I 1844 стимулирует синтез SVK-14-кератиноцитного ИЛ-6 концентрационнозависимым образом. Принимая среднее количество продуцируемого базисного ИЛ-6+3 СО (11,8+[3•0,8]=13,6 пг/мл) в качестве позитивной пороговой величины, экстракт I 1844 значительно стимулирует синтез ИЛ-6 в концентрациях, равных и выше концентраций, лежащих в области 0,12% (ИС=1,23); ЕС50 равняется 0,25%, а максимальный эффект достигается при концентрации 2%, при которой синтез ИЛ-6 стимулируется с фактором 2,3.
Исследования были распространены на другую линию кератиноцитов человека (линию А 431), равно как и на нормальные кератиноциты человека. В отличие от того, что наблюдается на линии SVK 14, экстракт I 1844 способен стимулировать продуцирование ИЛ-6 с фактором, превышающим 2, как в другой линии кератиноцитов (А 431), так и в первичной культуре нормальных кератиноцитов.
Таким образом, действие экстракта I 1844 не ограничено отдельными линиями, а может быть обобщено на нормальные клетки.
Специфичность действия экстракта I 1844
Специфичность действия экстракта I 1844 проверена на различных уровнях путем демонстрации того:
- что действие не обусловлено загрязнением бактериальным ЛПС, способность которого стимулировать продуцирование ИЛ-6 известна, и что клетки лимфоидного происхождения, которые также способны продуцировать ИЛ-6, не чувствительны к экстракту I 1844;
- что среди цитокинов, которые могут синтезироваться кератиноцитами, только продуцирование ИЛ-6 стимулируется под влиянием экстракта I 1844.
Присутствие полимиксина, являющегося ингибитором ЛПС, не изменяет индуктивное действие экстракта I 1844 на SVK 14-кератиноцитное продуцирование ИЛ-6, в то время как индуцированная ЛПС стимуляция логично ингибируется этим соединением. Этот результат указывает на то, что действие, наблюдаемое для экстракта I 1844, не обусловлено загрязнением бактериальным эндотоксином. Кроме того, оценка, проведенная с помощью В9-биоанализа, указывает на то, что продуцирование ИЛ-6, стимулируемое экстрактом I 1844, является биологически активным.
Сравнительное изучение различных клеточных мишеней показывает, что лимфоциты крови (PBMNC) в отличие от кератиноцитов являются нечувствительными к действию стимулирующей активности экстракта I 1844 на продуцирование ИЛ-6. Наоборот, ЛПС, способный стимулировать оба клеточных типа, является эффективным в обоих случаях. Таким образом, эти исследования показывают, что экстракт I 1844 стимулирует кератиноциты, не затрагивая клетки лимфоидного происхождения.
И наконец, экстракт I 1844 стимулирует синтез ИЛ-6 без одновременного увеличения уровня ИЛ-1, ИЛ-8 и ФНОα. Среди этих цитокинов ИЛ-8 является особенным ввиду того, что он способен в силу своих хемотаксических свойств локально рекрутировать нейтрофильные многоядерные клетки. Вследствие этого он играет важную роль в воспалении. Экстракт I 1844 стимулирует продуцирование ИЛ-6 без усиления продуцирования других изученных цитокинов.
Совокупность данных, а именно отсутствие ЛПС-эффекта, нацеленность только на кератиноциты и стимуляция, ограниченная ИЛ-6, позволяет сделать заключение о том, что действие экстракта I 1844 является специфичным и что оно не вызывает провоспалительного эффекта.
Следовательно, экстракт I 1844 воспроизводимо стимулирует кератиноцитное продуцирование ИЛ-6. Это действие наблюдается как на кератиноцитах человека, установленных в качестве линий, так и на нормальных кератиноцитах человека, происходящих из первичной культуры. Свойство экстракта I 1844 стимулировать синтез ИЛ-6 кератиноцитами является специфичным. Это обусловлено внутренней особенностью экстракта I 1844, а не экзогенным загрязнением, таким как бактериальный эндотоксин, оно не затрагивает клетки лимфоидного происхождения, и среди протестированных цитокинов оно наблюдается только для ИЛ-6: специфичность экстракта I 1844 является двоякой, как клеточной, так и молекулярной. Установление характера действия стимулирующей активности экстракта I 1844 на кератиноцитный ИЛ-6 делает возможным определение индексов стимуляции ИЛ-6, лежащих в интервале от 1,5 до 4,5, как критерия активности для любого образца, активность которого оценивается на клетках SVK 14.
Изучение характера влияния экстракта I 1844 на сокращение коллагенового волокна проводят, как описано далее.
Целью этого исследования является тестирование влияния экстракта I 1844 на сокращение коллагенового волокна. Используют гель коллагена, приготовленный путем смешивания фибробластов и коллагена. Под влиянием напряжений, вызываемых клетками, коллаген организуется в волокна. Это явление количественно характеризуется сокращением геля.
Используемой клеточной линией является штамм MRC5, представляющий собой штамм фибробластов, происходящий из легкого эмбриона человека. Клетки культивируют на среде ВМЕ (Basal Eagle Medium; основная среда Игла) с Glutamax I, содержащей 10% ФСТ, 1% пенициллин/стрептомицин, 1% фунгизона и 1% NEAA (заменимые аминокислоты) Gibco®.
Применяемый коллаген является коллагеном типа I, полученным из сухожилий крысиных хвостов, в виде раствора в концентрации 2 мг/мл в уксусной кислоте.
Способ получения гелей
Получение клеточной суспензии
После обработки трипсином полученной на 75-см2 чашке Петри культуры MRC5 готовят клеточную суспензию в DMEM, содержащей 10% ФСТ и антибиотики, в пропорции 1•106 клеток в миллилитре, с таким расчетом, чтобы получить 500000 клеток на гель.
С целью задержки гелеобразования смесь готовят во льду.
В указанных далее порядке и пропорциях при перемешивании добавляют различные составляющие:
1,76•DMEM - 2,3 мл
Коллаген, тип I - 1,5 мл
0,1н. NaOH - 0,25 мл
ФСТ - 0,45 мл
Клеточная суспензия - 0,5 мл
Эту хорошо гомогенизированную смесь распределяют на чашке Петри диаметром 5 см (тип бактериологический, NUNC) и инкубируют при 37oС. Гель образуется в течение 10 минут. Приблизительно через 2 часа с помощью лезвия скальпеля гель отделяют от стенок чашки.
Диаметр гелей далее измеряют через 24, 48 и 72 часа после образования, используя линейку, градуированную в миллиметрах.
Обработка
Экстракт I 1844 разводят в среде 1,76 х DMEM во время приготовления геля таким образом, чтобы получить конечные концентрации 0,1, 0,2 и 0,5%. В качестве контроля ингибирования сокращения используют раствор фенола в конечной концентрации 6,4 г/л.
Количественные анализы
Экстракт I 1844 в концентрации, равной и превышающей 0,1%, вызывает значительное усиление сокращения. Фенол, применяемый в качестве контроля ингибирования сокращения, дает 0% сокращения. Количественный анализ посредством наблюдений с помощью электронного микроскопа сократившихся гелей через 72 часа в присутствии и отсутствие экстракта I 1844 показывает наличие активных клеток, по-видимому, находящихся в фазе синтеза белка. Обработка экстрактом I 1844, по-видимому, не приводит к значительным изменениям в количестве и размере волокон.
Экстракт I 1844 эффективен в дозах, равных и превышающих 0,1%. Он усиливает активность фибробластов, которая обнаруживается по усилению сокращения коллагенового геля и только при наиболее высокой концентрации - по увеличению числа волокон.
Оценку характера влияния экстракта I 1844 на активацию коллагеназы проводят, как описано далее.
Целью этого исследования является тестирование влияния экстракта I 1844 на активацию коллагеназы. Для этого используют коллагеновый гель, приготовленный путем смешивания фибробластов и меченного тритием коллагена. В таком окружении фибробласты реорганизуют, изменяют и вызывают сокращение коллагена, приводя к образованию структуры, подобной структуре дермы. Для этого фибробласты продуцируют коллагеназу, высвобождающуюся в культуральную среду в латентной форме, которая может быть активирована под действием протеиназ. Активность коллагеназы измеряют по ее способности гидролизовать меченный тритием коллагеновый субстрат до растворимых радиоактивных пептидов. Латентная коллагеназа активируется трипсином, обработанным 1,1 -тозиламид-2-фенилэтилхлорметилкетоном (ТРСК). В качестве клеточной линии используют штамм MRC5, представляющий собой штамм фибробластов, происходящий из легкого эмбриона человека. Клетки культивируют на среде ВМЕ (Basal Eagle Medium; основная среда Игла) с Glutamax I, содержащей 10% ФСТ, 1% пенициллин/стрептомицин, 1% фунгизона и 1% NEAA (заменимые аминокислоты) Gibco®.
Применяемый коллаген является коллагеном типа I, полученным из сухожилий крысиных хвостов, в виде раствора в концентрации 2 мг/мл в уксусной кислоте. Меченный тритием коллаген применяется в виде раствора в концентрации 0,3 мг/мл в уксусной кислоте, и его активность составляет 0,06 мКи/мл (Dupont Net-660).
Способ получения гелей
Получение клеточной суспензии
После обработки трипсином полученной на 75-см2 чашке Петри культуры MRC5 готовят клеточную суспензию в DMEM, содержащей 10% ФСТ и антибиотики, в пропорции 1•106 клеток в миллилитре.
С целью задержки гелеобразования смесь готовят во льду.
В указанных далее порядке и пропорциях при перемешивании добавляют различные составляющие:
2•DMEM - 400 мкл
Коллаген типа I, меченный тритием - 300 мкл
0,1н. NaOH - 100 мкл
ФСТ - 100 мкл
Клеточная суспензия - 100 мкл
200 мкл этой хорошо гомогенизированной смеси вносят в 24-луночный планшет и инкубируют при 37oС. Радиоактивность составляет 0,4 мкКи на лунку.
Через один час 500 мкл среды DMEM + 3% ФСТ добавляют в каждую лунку.
Каждые 24 часа в течение 7 дней измеряют активность активированной и латентной коллагеназы. Для этого 500 мкл среды отбирают из каждой лунки и радиоактивность подсчитывают на жидкостном сцинтилляционном счетчике. 300 мкл раствора трипсин/ТРСК в концентрации 25 мг/мл в DMEM добавляют в каждую лунку и инкубируют при 37oС в течение 15 минут. Действие трипсина останавливают добавлением 200 мкл раствора ингибитора трипсина в концентрации 100 мг/мл в дистиллированной воде. 500 мкл среды отбирают и радиоактивность подсчитывают на жидкостном сцинтилляционном счетчике. В каждую лунку еще раз добавляют 500 мкл среды DMEM + 3% ФСТ и планшет еще раз оставляют инкубироваться в течение следующих 24 часов.
Экстракт I 1844 разводят в среде 2 • DMEM в ходе приготовления геля таким образом, чтобы получить конечные концентрации 0,1 и 0,5%.
Экстракт I 1844 не изменяет общую коллагеназную активность. За данный интервал времени соответственные пропорции латентной и активированной коллагеназы не изменяются относительно контроля, хотя увеличение в латентной коллагеназе наблюдается со временем в контролях и в образцах, подвергнутых обработке. Продукт не вызывает какой-либо активации коллагеназы.
При получении косметических композиций по настоящему изобретению составленные таким образом экстракты I 1844 смешивают с традиционными разбавителями и водными и неводными растворителями, совместимыми с местным применением, равно как и с активными компонентами фактически существующих композиций. Подходящие растворители и/или разбавители выбирают в соответствии с их способностью транспортировать активный компонент экстракта по изобретению в эпидермальные и дермальные кожные структуры.
Кроме этого, в Ames и ДНК-репарационных анализах показано, что экстракты I 1844 по изобретению полностью свободны от генотоксичности.
Их стабильность совместима с их применением в косметических композициях.
Косметические композиции по настоящему изобретению содержат экстракт I 1844 (в процентах) от 0,00001 до 5% по массе по отношению к общей массе композиции, смешанный с эксципиентами, которые обычно используются при получении косметических препаратов для нанесения на кожу.
Указанные проценты могут варьировать в пределах интервала, отмеченного выше, как функция внутренней активности экстракта I 1844, введенного в композицию.
Указанный экстракт I 1844 предпочтительно представлен в процентах в диапазоне от 0,0001 до 2% по массе по отношению к общей массе композиции.
При получении композиций по настоящему изобретению экстракт I 1844 смешивают с традиционными разбавителями и водными или неводными растворителями, совместимыми с применением на коже, равно как и с другими компонентами самой композиции. Подходящие растворители и/или разбавители выбираются в соответствии с их способностью к депонированию на коже активного экстракта I 1844 по изобретению.
Обычно эти композиции содержат эксципиенты или добавки, которые выбираются из ингредиентов, традиционно используемых в композициях, предназначенных для местного применения, в соответствии с необходимостью в конкретных рассматриваемых препаратах.
Они могут содержать, например, загустители, умягчители, смягчающие вещества, стабилизаторы, консерванты, пеногасители, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, красители и/или пигменты и/или другие типы наполнителей, отдушки, силиконы и разнообразные жировые субстанции.
Экстракт I 1844 всегда составляет от 0,00001 до 5% по массе, предпочтительно от 0,0001 до 2% по массе, по отношению к общей массе композиции, причем указанное количество вычислено по отношению к массе сухого экстракта.
Композиции по настоящему изобретению предпочтительно содержат экстракт ферментационного сусла нового штамма I 1844 в пропорциях (как отношение масса/масса в процентах), которые зависят от степени активности используемого экстракта и, следовательно, от концентрации сухой субстанции и от специфической активности этой субстанции.
Для получения косметических композиций по изобретению может оказаться подходящим использование неочищенных экстрактов, которые получаются непосредственно после ферментации без какой-либо стадии очистки, в пропорциях от 0,00001 до 5%, преимущественно от 0,0001 до 2%, еще лучше от 0,001 до 2% по массе по отношению к общей массе композиции, и предпочтительно от 0,01 до 2% по массе по отношению к общей массе композиции.
Эти проценты по массе рассчитаны, естественно, на основе массы полученного сухого экстракта.
Более конкретно композиции по настоящему изобретению содержат более или менее очищенные экстракты, которые растворены и которые могут быть получены путем ферментации штамма Rhodotorula, депонированного в C.N.C.M. Пастеровского института под номером I 1844, или его мутантов-продуцентов, с эксципиентами, обычно используемыми для препаратов такого типа, такими как упомянутые выше.
Композиции по настоящему изобретению могут быть в виде эмульсии, в которой составляющее или смесь составляющих, возможно, со стабилизатором, объединяют с эксципиентами, которые в настоящее время используются в косметических композициях и которые совместимы с указанными составляющими, такими как ланолин или растительные, минеральные или синтетические масла.
Кроме того, композиции по изобретению могут быть представлены в форме геля в подходящих эксципиентах, таких как эфиры целлюлозы или другие гелеобразующие агенты, как, например, акриловые производные, и могут содержать действующее начало в растворенной форме или суспендированное в микрогранулах.
Кроме того, композиции по изобретению могут иметь форму лосьона или раствора, в котором разбавляется или микродиспергируется смесь составляющих.
Таким образом, композиции по изобретению могут быть в форме микродисперсии в жидкости, содержащей воду, равно как и одно или более чем одно совместимое поверхностно-активное вещество. Дисперсии проявляют свойства микроэмульсий, в частности по прозрачности и низкой вязкости, и практически выступают как истинные растворы. Они также могут быть приготовлены для незамедлительного употребления.
Одной из преимущественных форм композиций по изобретению является жидкость, которая применяется местно посредством адгезивной подложки, обозначенной здесь и далее как "пластырь", причем этот пластырь обеспечивает возможность регулируемой диффузии активных компонентов, которая, возможно, активируется физическими явлениями, как, например, электрическими микротоками.
Кроме того, косметические композиции по настоящему изобретению могут содержать другие активные компоненты, обладающие любым эффектом того же типа, каким обладают стимуляторы синтеза коллагена, ингибиторы коллагеназы или эластазы, вазопротекторы или продукты, которые участвуют в стимуляции пролиферации кератиноцитов или стимуляции синтеза внеклеточных составляющих матрикса (коллагена, эластина, гликозаминогликанов), или продукты, которые полезны для этого типа композиции для местного применения, такие как ускорители клеточной регенерации, ингибиторы коллагеназы или эластазы, вазопротекторы, поглотители радикалов, активные агенты для восстановления функции кожного барьера (церамиды, незаменимые жирные кислоты) или увлажнители.
Композиции по настоящему изобретению обладают хорошей стабильностью и могут сохраняться в течение необходимого времени использования при температуре между -10 и 60oС без осаждения составляющих или разделения фаз либо уменьшения активности, которые могут ограничить их применение.
Эти композиции очень хорошо переносятся, они не проявляют никакой фототоксичности, и применение их на коже в течение продолжительных периодов времени не дает никаких побочных эффектов.
Композиции по настоящему изобретению в различных формах их представления могут использоваться как препараты, предназначенные для предупреждения и/или борьбы со старением кожи, независимо внутренним или внешним по своей природе, главным образом, актиническим старением.
Косметические композиции по настоящему изобретению, предназначенные против старения, могут быть приведены в контакт с эпидермисом или волосяной либо волосистой системой для изменения их внешнего вида и защиты их.
Хорошо известно, что плотность является существенным качеством для поддержания кожи молодой. Фактически она составляет истинный маркер жизнеспособности клеток, и ее исчезновение обусловливает развитие других симптомов старения, таких как образование морщин или отсутствие блеска.
Пока дерма полностью сохраняет свою прочность и эластичную гибкость, эпидермис также остается гладким, гибким и в хорошем тонусе. Старение кожи представляет собой сложный феномен, который начинается в период расцвета молодости. Свободные радикалы, генетические факторы и солнце являются некоторыми из его причин, которые, однако, многообразны и изменчивы. Все эти структуры кожи поражаются на всех уровнях, и со временем количество клеток уменьшается. Они продуцируют ткань более низкого качества, которая теряет свою первоначальную прочность и свою эластичную природу.
Следует отметить, что метаболизм эпидермальных клеток замедляется и что их базальный слой теряет свою извилистую форму и становится прямолинейным. Суммарная популяция кератиноцитов регрессирует, и таким образом, ороговевший слой теряет свою эффективность. Вдобавок он плохо регулирует испарение воды. Также следует отметить, что активность фибробластов, которые составляют ключевые клетки дермы, уменьшается с течением лет. Продуцируемый коллаген тогда становится волокнистым и жестким. Синтез эластина снижается еще раньше. Таким образом, свойства дермы изменяют ее строение, и она становится тоньше, разрушается и становится менее стойкой к сокращениям мышц. Это ослабление вызывает образование щелей, в результате которых образуются морщины.
Реорганизующая гладкость формула косметических композиций по изобретению восстанавливает на всех уровнях кожи природные основы процесса ее упрочнения.
Они отвечают за очень незначительные микроизменения кожи, результатом которых является потеря прочности, эластичности и молодости кожи.
Косметические композиции по данному изобретению также предназначены для зрелой кожи, для которой они составляют средства для ухода против ее старения. Экстракт I 1844 затем действует на фактор восстановления кожи, таким образом, воссоздавая как ее структурный (прочность и тонус), так и поверхностный (комфорт и блеск) или глубокий (прочность и тонус) и поверхностный (блеск и комфорт) физиологический баланс. Оживляющими или реорганизующими косметологическими композициями по изобретению можно пользоваться в течение дня и/или на ночь соответственно.
Кроме того, косметические композиции могут содержать другие дополнительные активные агенты. Ими могут быть, например, витамины или агенты, устраняющие недостатки кожи.
Их несравненные реорганизующие качества также усиливаются и расширяются благодаря синергичности природы комбинации, например, с экстрактом морского планктона. Экстракт, полученный из морского планктона, делает возможным обеспечение оптимальной активизации увлажнения и упрочнения кожи.
Возможно также использование фитостимулинов, таких как фруктовые экстракты, подобные, например, фитостимулинам яблока, выбранным за их способность к поглощению радикалов. Они являются особенно активными новыми поглотителями радикалов, обогащенными флавонами, стеринами, незаменимыми жирными кислотами и витаминами, включая витамин Е. Тогда кожа оказывается максимально защищенной от опасности свободных радикалов, которые генерируются, в частности, под воздействием ультрафиолетовых лучей и стресса.
Перфторированные масла также могут быть использованы в косметических композициях по изобретению; вдобавок свойство этих перфторированных масел заключается в разглаживании шероховатых частей и впадин микрорельефа структуры кожи. Они разглаживают линии лица и заметно улучшают поверхность кожи подобно "отливке формы" истинной молодости.
Таким образом, косметические композиции по изобретению стимулируют обновление эпидермальных клеток и продуцирование коллагена и эластина, гарантируют оптимальный повторный "запуск" природного процесса увлажнения и даже более полно защищают кожу от свободных радикалов, составляющих один из важнейших факторов ее старения. Тогда подвергаемый повторному усилению действия эпидермис снова будет иметь улучшенное увлажнение, и кожа, очевидно, должна стать моложе, глаже и повысить свой тонус. Линии лица, в частности, становятся более отчетливо очерченными, и, по-видимому, кожа реорганизуется изнутри, таким образом, становясь заметно более прочной.
Экстракт I 1844, содержащийся в упомянутых выше косметических композициях, действует на кожу как унифицирующий активный агент.
Клинические исследования проводили на 120 женщинах 30-60-летнего возраста. Они тестировали качество косметических композиций по изобретению в продолжение 4 недель.
87% тестируемых отмечали заметную эффективность продукта в отношении прочности, гладкости и увлажненности их кожи. 82% высоко оценили их главные косметические качества, например: легкость применения, быстрое проникновение, полное отсутствие жирной пленки, равно как и ощущение здоровья и комфорта.
Другие клинические исследования состояли в демонстрации эффективности косметических композиций по изобретению в отношении рельефа кожи, микродепрессионной сети, биомеханических свойств кожи и ее яркости.
Серия, специально предназначенная для зрелой кожи, позволила отметить, что при дневном уходе за чувствительной кожей и сухой кожей получено статистически значимое уменьшение мелких морщинок и микрорельефа, улучшение четкости и внешнего вида микродепрессионной сети, равно как и улучшение тонуса кожи.
Дневной уход за нормальной кожей и смешанной кожей продемонстрировал статистически значимое уменьшение мелких морщинок, улучшение четкости микродепрессионной сети и улучшение тонуса кожи.
Ночной уход против морщин/для увеличения прочности показал статистически значимое уменьшение глубоких морщин, мелких морщинок и микрорельефа, улучшение четкости и внешнего вида микродепрессионной сети и улучшение прочности и тонуса кожи.
Регенерирующий интенсивный уход выявил статистически значимое уменьшение морщин и микрорельефа, улучшение четкости и внешнего вида микродепрессионной сети.
Эти разнообразные клинические результаты подтверждаются с помощью различных методов, хорошо известных специалистам в области косметологии, таких как, например микрозондовая техника магнитно-резонансной визуализации (МРВ), которая дает возможность измерить увлажнение; трансмиссионная микроскопия для оценки восстановления кожи; эхография высокого разрешения для измерения толщины кожи или 31[Р]-спектрометрия для измерения клеточной активности.
Объектом данного изобретения также является способ косметического лечения, отличающийся тем, что косметически эффективное количество экстракта I 1844 в наполнителе для косметического применения наносят на эпидермис и/или волосяную либо волосистую систему.
Следующие далее примеры иллюстрируют данное изобретение, однако не ограничивают его.
Пример 1
Приготовление экстракта, полученного из штамма Rhodotorula I 1844.
1.1. Ферментация
Ферментацию штамма Rhodotorula I 1844 осуществляют на различных культуральных средах.
1.1.1
а) Штамм размножают на чашках Петри на среде для субкультивирования.
Автолизат Saccharomyces cerevisiae - 10 г
Триптон - 10 г
Глюкоза - 20 г
Агар - 15 г
Очищенная вода, сколько нужно - 1 л
Культуру инкубируют в течение 48 часов при 30 oС. После этого получают дрожжевую суспензию, добавляя к каждой чашке Петри 10 мл подходящей среды для восстановления следующего состава:
NaCl - 9,00 г
KCl - 0,42 г
CaCl2 - 0,48 г
NaHCO3 - 0,20 г
Глицерин - 150,00 г
3-[N-Морфолино]пропансульфоновая кислота - 3,00 г
Очищенная вода, сколько нужно - 1 л
б) 5 мл этой суспензии используют для инокуляции 2-литровой колбы Эрленмейера, содержащей 500 мл культуральной среды следующего состава:
Автолизат Saccharomyces cerevisiae - 10 г
Пептонизированное молоко - 20 г
Кукурузный экстракт - 10 г
Глюкоза - 30 г
Раствор микроэлементов - 10 мл
Очищенная вода, сколько нужно - 1 л
в которой раствор микроэлементов состоит из следующих соединений:
FeSO4•7H2O - 1 г
MnSO4•4H2O - 1 г
CuCl2•2H2O - 0,025 г
CaCl2•2H2O - 0,1 г
Н3ВО3 - 0,56 г
(NН4)6Мo24•4Н2O - 0,02 г
ZnSO4•7H2O - 0,2 г
Очищенная вода, сколько нужно - 1 л
Культуру растят в течение 48 часов при 30oС в 2-литровых колбах Эрленмейера с перемешиванием при 150 об/мин.
1.1.2.
а) 0,2 мл дрожжевой суспензии из партии вторичного посева используют для инокуляции колбы емкостью 500 мл, содержащей 100 мл культуральной среды следующего состава:
Автолизат Saccharomyces cerevisiae - 20 г
Триптон - 20 г
Глюкоза - 20 г
Раствор микроэлементов - 10 мл
Очищенная вода, сколько нужно - 1 л
Раствор микроэлементов идентичен раствору, описанному в примере 1.1.1.
Культуру растят в течение 24 часов при 30oС и перемешивании при 200 об/мин.
б) 100 мл полученной выше культуры используют для инокуляции 20-литрового ферментатора, содержащего 12 литров среды, состав которой идентичен составу из примера 1.1.1.б, к которой добавлен 1 мл/л Struktol®.
Культуру растят при 30oС со скоростью аэрации 1 объем на один объем в минуту, варьируя перемешивание таким образом, чтобы поддерживать давление растворенного кислорода на уровне 30%. Значение рН подводят до 5,0 с помощью аммиака.
Через 25 часов для поддержания роста добавляют концентрированный раствор глюкозы.
Культивирование останавливают по достижении плато кривой роста через 32 часа.
1.1.3.+
Таким же образом, как в примере 1.1.2, получают 100 мл культуры во встряхиваемой колбе и эту культуру используют для инокуляции 20-литрового ферментатора, содержащего 12 литров культуральной среды следующего состава:
Автолизат Saccharomyces cerevisiae - 20 г
Триптон - 20 г
Глюкоза - 30 г
Раствор микроэлементов - 10 мл
Struktol® - 1 мл
Очищенная вода, сколько нужно - 1 л
Раствор микроэлементов идентичен раствору, описанному в примере 1.1.1.
Культуру растят в тех же самых условиях, как в примере 1.1.2.б.
Через 31 час для поддержания фазы роста добавляют концентрированный раствор глюкозы. Культивирование останавливают через 34 часа по достижении плато кривой роста.
1.1.4
Готовят четыре встряхиваемых колбы для культивирования емкостью по 2 литра, содержащие по 500 мл среды того же самого состава, что и в примере 1.1.2.а.
Каждую из четырех колб инокулируют дрожжевой суспензией из партии вторичного посева из расчета 0,75 мл суспензии на колбу. Культуры растят в течение 24 часов при 30oС и 200 об/мин. Затем их объединяют для того, чтобы инокулировать 450-литровый ферментатор, содержащий 230 литров среды следующего состава:
Автолизат Saccharomyces cerevisiae - 30 г
Триптон - 20 г
Рофероза (Roferose) - 30 г
Микроэлементы - 10 мл
Struktol - 1 мл
Очищенная вода, сколько нужно - 1 л
Раствор микроэлементов идентичен раствору, описанному в примере 1.1.1.
Культуру растят при 30oС со скоростью аэрации 1 объем на один объем в минуту, варьируя перемешивание таким образом, чтобы поддерживать давление растворенного кислорода близким к 30%.
Значение рН подводят до 5,5 с помощью аммиака и через 30 часов для поддержания фазы роста добавляют концентрированный раствор глюкозы.
Культивирование останавливают через 37 часов 30 по достижении плато кривой роста.
1.1.5
По 0,75 мл дрожжевой суспензии из партии вторичного посева используют для инокуляции каждой из шести 2-литровых колб, содержащих по 500 мл культуральной среды следующего состава:
Автолизат Saccharomyces cerevisiae - 20 г
Гидролизат казеина - 20 г
Глюкоза - 20 г
Микроэлементы - 10 мл
Очищенная вода, сколько нужно - 1 л
Раствор микроэлементов идентичен раствору, описанному в примере 1.1.1.
Культуру растят в течение 24 часов при 30oС с перемешиванием при 220 об/мин.
Затем шесть колб объединяют для того, чтобы инокулировать 450-литровый ферментатор, содержащий 300 литров среды следующего состава:
Автолизат Saccharomyces cerevisiae - 30 г
Гидролизат казеина - 20 г
Глюкоза - 20 г
Микроэлементы - 10 мл
Struktol - 1 мл
Очищенная вода, сколько нужно - 1 л
Раствор микроэлементов идентичен раствору, описанному в примере 1.1.1.
Культуру растят при 30oС со скоростью аэрации 1 объем на один объем в минуту, варьируя перемешивание таким образом, чтобы поддерживать давление растворенного кислорода близким к 30%.
Значение рН подводят до 5,5 с помощью аммиака и через 35 часов для поддержания фазы роста добавляют концентрированный раствор глюкозы.
Культивирование останавливают через 40 часов по достижении плато кривой роста.
1.2. Экстракция
1.2.1
Экстракцию осуществляют из 9 литров сусла, полученного согласно примеру 1.1.1 (18 штук 2-литровых колб, содержащих по 500 мл сусла).
Центрифугирование осуществляют при 9000 об/мин (14000 g) в течение 10 мин и получают 154 г влажной биомассы.
Осуществляют контактирование этой биомассы с 6 литрами смеси дихлорметан/метанол (о/о) при комнатной температуре с перемешиванием в течение ночи.
Далее биомассу удаляют фильтрованием и органическую фазу упаривают досуха под вакуумом при 50oС.
Остаток, полученный после упаривания (9,8 г), составляет сухой экстракт, и его повторно растворяют в 112 мл метанола.
Полученную таким образом фракцию фильтруют через 0,2 мкм фильтр и испытывают в биологическом тесте на стимуляцию кератиноцитов; он показывает индекс стимуляции (ИС) для кератиноцитов, равный 1,9 при 200-кратном разведении (1/200).
1.2.2
Экстракцию осуществляют из 12 литров культурального сусла из примера 1.1.2.
Следуют тому же протоколу, что и в примере 1.2.1, но экстракцию осуществляют из 1900 г полученной влажной биомассы 80 литрами смеси дихлорметан/метанол (50/50), то есть используя соотношение (смесь растворителей)/(влажная биомасса), близкое к 40 литрам смеси растворителей на 1 кг влажной биомассы.
После контактирования в течение ночи биомассу удаляют фильтрованием и органическую фазу упаривают досуха под вакуумом при 50oС.
Получают 93,8 г сухого экстракта, который переводят в 375 г смеси этанол/вода (50/50; о/о).
Раствор, отфильтрованный через 0,2 мкм фильтр, содержащий полученный таким образом сухой экстракт из расчета 0,2 г/г, показывает индекс стимуляции (ИС), равный 2,1 при разведении 1/200.
1.2.3
Экстракцию осуществляют из 11 литров культуры из примера 1.1.3. Следуют тому же протоколу, что и в примере 1.2.2, и 2,2 кг полученной влажной биомассы экстрагируют 80 литрами смеси дихлорметан/метанол (50/50; о/о).
Далее биомассу удаляют посредством фильтрования и органическую фазу упаривают досуха под вакуумом при 50oС.
Получают 98 г сухого экстракта, который переводят в 392 г смеси этанол/вода (50/50; о/о) таким образом, чтобы получить раствор, содержащий 0,2 г/г.
После фильтрования через 0,2 мкм фильтр этот раствор испытывают в биологическом тесте на стимуляцию кератиноцитов; он показывает индекс стимуляции (ИС), равный 2,8 для разведения 1/200.
1.2.4
Экстракцию осуществляют из 12 литров культуры, полученной таким же образом, как и в примере 1.1.3, но в этом случае для отделения биомассы применяют центрифугу непрерывного действия. Получают 1,6 кг влажной биомассы; эту биомассу обрабатывают 80 литрами смеси дихлорметан/метанол (50/50; о/о).
После контактирования в течение ночи биомассу удаляют фильтрованием и органическую фазу упаривают досуха под вакуумом при 50oС.
Получают 83 г сухого экстракта, который переводят в 747 г смеси этанол/вода (50/50; о/о) таким образом, чтобы получить раствор, содержащий 0,1 г/г сухого экстракта.
Полученный раствор фильтруют через 0,2 мкм фильтр; он показывает индекс стимуляции (ИС), равный 3,5 для разведения 1/100.
1.2.5
Проводят экстракцию из 230 литров культуры из примера 1.1.3; после отделения биомассы с помощью центрифуги непрерывного действия получают 29 кг влажной биомассы. 8 кг этой биомассы обрабатывают 80 литрами смеси дихлорметан/метанол (50/50; о/о), то есть используя соотношение (смесь растворителей)/(влажная биомасса), близкое к 10 литрам смеси растворителей на 1 кг влажной биомассы.
После контактирования в течение ночи биомассу удаляют фильтрованием и органическую фазу упаривают досуха под вакуумом при 50oС.
После упаривания органической фазы получают 314 г сухого экстракта, который переводят в 2826 г смеси этанол/вода (50/50; о/о).
Полученный таким образом раствор (0,1 г/г сухого экстракта) показывает индекс стимуляции (ИС), равный 2,8 для разведения 1/100.
1.2.6
Проводят экстракцию из 330 литров культуры из примера 1.1.5. Используя центрифугу непрерывного действия, получают 54,4 кг влажной биомассы. 27,7 кг этой биомассы обрабатывают 272 литрами смеси дихлорметан/метанол (50/50; о/о), то есть используя соотношение (смесь растворителей)/(влажная биомасса), близкое к 5 литрам смеси растворителей на 1 кг влажной биомассы.
После контактирования в течение ночи биомассу удаляют фильтрованием и органическую фазу упаривают досуха под вакуумом при 50oС.
После упаривания органической фазы получают 1447 г сухого экстракта, который переводят в 13023 г смеси этанол/вода (50/50; о/о) таким образом, чтобы получить раствор, содержащий 0,1 г сухого экстракта. После фильтрования через 0,2 г фильтр этот раствор испытывают в биологическом тесте на стимуляцию кератиноцитов; он показывает индекс стимуляции, равный 2,6 для разведения 1/100.
В следующих далее примерах количества указаны в процентах по массе.
Пример 2. Дневной крем для лица
Карбомер - 0,15
Триэтаноламин - 0,1
Пропиленгликоль - 5
Ксантановая смола - 0,2
Глицерин - 3
Глицерилстеарат - 3
ПЭГ стеарат - 2
Стеарет-20 (STEARETH-20) - 2
Октилпальмитат - 10
Цетиловый спирт - 2
Стеариловый спирт - 0,25
Перфторированное масло - 0,2
Холестерин - 0,5
Синтетический воск - 5
Диметикон - 5
Экстракт морского планктона - 0,5
Яблочный экстракт - 3
Бисаболол - 0,5
Токоферилацетат - 1
Экстракт виноградных семечек - 0,5
Консервант - 0,8
Отдушка - 0,5
Экстракт I 1844 - 0,1
Деминерализованная вода, сколько нужно - 100
Пример 3. Концентрат для ухода за лицом
Бутиленгликоль - 5
Карбомер - 0,2
Триэтаноламин - 1
Полисорбат-60 - 0,8
Сорбитанстеарат - 0,6
Жидкий вазелин - 2
Ланолин - 0,3
Дипеларгонат - 5
Триглицерид - 5
Цетиловый спирт - 0,25
Дикаприлат/дикапрат - 5
Глицерилстеарат - 3,00
Растительный стерол - 0,5
Диметикон - 0,5
Стеариновая кислота - 2
Пантенол - 0,5
Натрия гиалуронат - 0,05
Бисаболол - 0,1
Токоферилацетат - 1
Соевый экстракт - 0,5
Консервант - 0,8
Отдушка - 0,5
Экстракт I 1844 - 0,25
Деминерализованная вода, сколько нужно - 100
Пример 4. Жидкая эмульсия для лица
Бутиленгликоль - 5
Ксантановая смола - 0,2
Глицерилстеарат - 1
ПЭГ стеарат - 1
Триглицерид - 5
Цетиловый спирт - 0,5
Титана оксид - 1
Диметикон - 3
Полиакриламид - 5
Церамиды - 1
Пантенол - 1
Натрия гиалуронат - 0,05
Бисаболол - 0,1
Токоферилацетат - 1
Консервант - 0,7
Отдушка - 0,5
Экстракт I 1844 - 0,15
Деминерализованная вода, сколько нужно - 100
Пример 5. Лосьон
ПЭГ-32 - 5
Фосфатный буфер - 0,1
Диметикона сополиол - 5
Полисорбат-20 - 0,1
Полипропиленгликоль - 10
Экстракт морского планктона - 1
Яблочный экстракт - 5
Бисаболол - 0,5
Токоферилацетат - 0,5
Экстракт белков пшеницы - 2
Консервант - 1
Отдушка - 0,3
Экстракт I 1844 - 0,1
Деминерализованная вода, сколько нужно - 100
Пример 6. Гель
Карбомер - 1
Нейтрализатор - 0,25
Пропиленгликоль - 5
Пантенол - 1
Экстракт алоэ ВЕРА - 1
Экстракт василька - 5
Дрожжевой экстракт - 0,5
Экстракт пшеницы - 0,25
Натрия гиалуронат - 0,01
Консервант - 0,7
Экстракт I 1844 - 0,05
Деминерализованная вода, сколько нужно - 100
Пример 7. Кремообразная маска
Карбомер - 0,5
Триэтаноламин - 0,5
Сорбитанстеарат - 1,5
ПЭГ стеарат - 3
Цетиловый спирт - 5
Растительное масло - 20
Титана оксид - 0,7
Глицерин - 7
Токоферол - 0,75
Яблочный экстракт - 3
Бисаболол - 0,5
Ретинилпальмитат - 0,5
Натрия гиалуронат - 0,02
Консервант - 1
Отдушка - 0,3
Экстракт I 1844 - 0,1
Красители -
Деминерализованная вода, сколько нужно - 100
Пример 8. Маска-ополаскиватель
Акриловый сополимер - 1
Триэтаноламин - 1
Глицерин - 15
C14-C16Олевинсульфаты - 5
Эфир и кокаот ПЭГ - 2
Экстракт морского планктона - 1
Яблочный экстракт - 5
Соевый экстракт - 0,5
Аскорбилфосфат - 3
Экстракт белкового шелка - 2
Консервант - 0,8
Отдушка - 0,5
Экстракт I 1844 - 0,15
Деминерализованная вода, сколько нужно - 100о
Изобретение относится к области медицины, а именно к биомолекулярной косметике. Сущность способа состоит в том, что разработана косметическая композиция, содержащая, по крайней мере, одно соединение с активностью, стимулирующей продуцирование ИЛ-6 кератиноцитами, и эксципиенты, пригодные для косметических препаратов. Технический результат изобретения состоит в расширении арсенала косметических средств на основе иммуномодулирующих препаратов. 5 c. и 6 з.п.ф-лы.
| МИКРОКАЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ ЭЛЕМЕНТ^ '"^''''''''^-•"••llilJ^iBA | 0 |
|
SU335554A1 |
| L | |||
| Arden et al | |||
| Limphokines | |||
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
