СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ СЕМЕЙСТВА L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ, ШТАММ БАКТЕРИИ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ L-АМИНОКИСЛОТЫ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2003 года по МПК C12N1/21 C12P13/04 C12P13/10 C12P13/14 C12P13/24 C12N1/21 C12R1/19 

Предпосылки создания изобретения
Настоящее изобретение относится к технике в области промышленности с использованием микробов. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина методом ферментации и к бактерии, используемой в этом способе. L-Глутаминовая кислота, L-пролин и L-аргинин являются важными соединениями, входящими в пищу, медикаменты и подобные товары.

L-Пролин и L-аргинин синтезируются клетками Е. coli из общего предшественника - L-глутаминовой кислоты. Поэтому уровень продукции L-пролина и L-аргинина зависит от наличия их общего предшественника, L-глутаминовой кислоты.

Штаммы Е. coli., имеющие повышенный уровень синтеза L-глутаминовой кислоты, известны. В частности, мутанты, выведенные из штамма Е. coli К 12 и являющиеся дефицитными или обладающие пониженной активностью 2-кетоглутарат дегидрогеназы, могут продуцировать L-глутаминовую кислоту с довольно высокой продуктивностью (патенты США 5393671 и 5908768).

Также известно, что некоторые мутанты Е. coli могут продуцировать L-пролин и L-аргинин. Они были выделены среди мутантов, устойчивых к аналогам этих аминокислот, а также путем клонирования некоторых важных для их биосинтеза генов (публикация патентной заявки Соединенного Королевства 2080825 А).

Краткое описание настоящего изобретения
Предметом настоящего изобретения является предоставление новой бактерии, обладающей способностью к продукции L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина, а также способа получения L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина с использованием бактерии, обладающей способностью к продукции L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ауксотрофы Е. coli no L-изолейцину, дефицитные по гену ilvA, продуцируют L-глутаминовую кислоту. Вдобавок дефицитные по гену ilvA штаммы могут быть использованы в качестве исходных штаммов для селекции продуцентов L-пролина и L-аргинина. Другими словами, авторы настоящего изобретения обнаружили, что ауксотрофность может быть использована для улучшения продуцентов L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина. Таким образом, было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение предоставляет следующее:
1. Бактерию Escherichia. которая является ауксотрофной по L-изолейцину и обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина.

2. Бактерию Escherichia no п.1, которая является дефицитной по активности одного из ферментов биосинтеза L-изолейцина.

3. Бактерию Escherichia по п.2, которая является дефицитной по активности треониндеаминазы.

4. Бактерию Escherichia по любому из пп.1-3, которая является бактерией Escherichia coli.

5. Способ получения L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia, описанной в любом из пп. 1-4, в питательной среде, содержащей L-изолейцин, с целью продукции и накопления L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина в питательной среде, и выделения L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина из культуральной жидкости.

Подробное описание настоящего изобретения
Бактерия согласно настоящему изобретению
Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, являющаяся ауксотрофной по L-изолейцину и обладающая способностью к продукции L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина. Примером бактерии Escherichia является Escherichia coli.

Выражение "бактерия обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина" означает, что данная бактерия накапливает значительное количество L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина в среде при выращивании бактерии в этой среде или содержание L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина повышается в самой бактерии. Выражение "бактерия является ауксотрофной по L-изолейцину" означает, что для роста бактерии в питательной среде необходимо наличие L-изолейцина (обычно не менее чем 10 мг/л).

Бактерия согласно настоящему изобретению продуцирует, по крайней мере, L-глутаминовую кислоту, L-пролин или L-аргинин и может продуцировать два или более вида L-аминокислот.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, обладающей способностью к продукции L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина, ауксотрофности по L-изолейцину либо путем придания бактерии, являющейся ауксотрофной по L-изолейцину, способности к продукции L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина.

Для придания ауксотрофности по L-изолейцину может быть использован метод, включающий в себя стадии обработки бактерии Escherichia с целью мутагенеза, предоставления возможности бактерии Escherichia образования колоний на агаризованной среде, содержащей L-изолейцин, переноса колоний на агаризованную среду, не содержащую L-изолейцин, и отбора штаммов, которые не могут расти на агаризованной среде, не содержащей L-изолейцин. Мутагенез включает в себя облучение УФ-светом и обработку с помощью мутагенных агентов, обычно используемых для целей мутагенеза, таких как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) и азотистая кислота. В качестве альтернативы, отбор может быть произведен среди мутантов, возникших естественньм путем.

Ауксотрофность по изолейцину появляется вследствие дефицита активности в любом из ферментов биосинтеза L-изолейцина (активности ферментов, катализирующих реакции биосинтеза L-изолейцина). К ферментам биосинтеза L-изолейцина относятся треониндеаминаза, синтаза ацетогидроксикислот, изомероредуктаза ацетогидроксикислот, дегидратаза дигидроксикислот. Предпочтительно, чтобы дефицитной была активность треониндеаминазы. Выражение "активность является дефицитной" обычно означает, что внутриклеточная активность фермента ниже, чем его активность в природном штамме, в случае же, когда штамм с дефицитом активности этого фермента получен путем модификации с использованием метода рекомбинации генов или подобным методом, внутриклеточная активность фермента ниже, чем его активность в исходном штамме до модификации.

С целью получения описанного выше фермента с дефицитом активности в ген, кодирующий этот фермент, методами традиционного мутагенеза или генной инженерии может быть введена мутация, обуславливающая дефицит активности этого фермента.

Примерами методов мутагенеза являются, например, метод, использующий облучение с помощью рентгеновских лучей или УФ-света, метод, использующий обработку с помощью мутагенных агентов, таких как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин, или другой подобный метод. Позицией в гене, в которую вводится мутация, может быть участок, кодирующий фермент, или участок регуляции экспрессии, такой как промотор.

Примерами методов генной инженерии являются, например, генная рекомбинация, генная трансдукция, слияние клеток и подобные методы. Например, в целевой ген вводится ген, придающий устойчивость к антибиотику, с целью продукции функционально неактивного гена (дефективного гена). Затем, такой дефективный ген вводится в клетку микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, и целевой ген в хромосоме заменяется дефективным геном методом гомологичной рекомбинации (разрушение гена).

Является ли микроорганизм дефицитным по активности целевого фермента или фермент имеет пониженную активность, а также степень понижения активности могут быть определены путем измерения активности фермента в экстракте бактериальных клеток или очищенной фракции штамма-кандидата с последующим сравнением с активностью в природном или исходном штамме. В зависимости от целевого фермента желаемый вариант может быть выбран на основе фенотипа этого варианта.

Для того, чтобы придать способность к продукции L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина, могут быть использованы традиционные методы для выведения бактерий Escherichia или подобных им, такие как метод получения ауксотрофных мутантных штаммов, штаммов, устойчивых к аналогам L-аминокислот, мутантных штаммов с контролем метаболизма, и методы получения рекомбинантных штаммов, в которых активность ферментов биосинтеза L-аминокислот повышена (см. "Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1-я редакция, опубликовано 30 мая 1986, с.77-100). При выведении бактерий - продуцентов аминокислот такие характеристики, как ауксотрофность, устойчивость к аналогам L-аминокислот и мутации контроля метаболизма, могут быть приданы этим бактериям по отдельности или в комбинации двух или более. Активности ферментов биосинтеза L-аминокислот могут быть повышены по отдельности или в комбинации двух или более. Кроме того, придание таких характеристик, как ауксотрофность, устойчивость к аналогам L-аминокислот и мутации контроля метаболизма, может происходить в комбинации с повышением активности ферментов биосинтеза L-аминокислот.

Например, бактерии - продуценты L-глутаминовой кислоты могут быть выведены как мутанты, проявляющие ауксотрофность по олеиновой кислоте или подобной ей.

Также, способность к продукции L-глутаминовой кислоты может быть придана, например, введением ДНК, кодирующей любой из таких ферментов, как глутаматдегидрогеназа (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) 61-268185/1986), глутаминсинтетаза, глутаматсинтаза, изоцитратдегидрогеназа (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) 62-166890/1987 и 63-214189/1988), аконитатгидратаза (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) 62-294086/1987), цитратсинтаза (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) 62-201585/1987 и 63-119688/1988), фосфоенолпируваткарбоксилаза (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) 60-87788/1985 и 62-55089/1987), пируватдегидрогеназа, пируваткиназа, фосфоенолпируватсинтаза, енолаза, фосфоглицеромутаза, фосфоглицераткиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, фруктозобифосфатальдолаза, фосфофруктокиназа (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) 63-102692/1988), глюкозофосфатизомераза, глутамин-оксоглутаратаминотрансфераза (WО 99/07853) и так далее.

Далее, бактерия согласно настоящему изобретению может быть создана путем придания дефицита активности ферменту, катализирующему реакцию образования соединения, отличного от L-глутаминовой кислоты, в результате ответвления от пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Ферментами, катализирующими реакцию образования соединения, отличного от L-глутаминовой кислоты, в результате ответвления от пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты, являются α-кетоглутаратдегидрогеназа, изоцитратлиаза, фосфатацетилтрансфераза, ацетаткиназа, синтаза ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтаза, формиатацетилтрансфераза, лактатдегидрогеназа, глутаматдекарбоксилаза, 1-пирролин дегидрогеназа и так далее.

Способность к продукции L-пролина может быть придана бактерии, например, путем получения γ-глутамилкиназы, у которой утрачена чувствительность к ингибированию L-пролином по типу обратной связи, и/или путем разрушения системы деградации L-пролина. Примером метода получения бактерии с γ-глутамилкиназой, у которой утрачена чувствительность к ингибированию L-пролином по типу обратной связи, является метод, включающий введение в клетки ДНК, кодирующей γ-глутамилкиназу, у которой утрачена чувствительность к ингибированию L-пролином по типу обратной связи (J. Bacteriol. , 170, 5943(1988)). Примером метода разрушения системы деградации L-пролина является метод введения в ген пролиндегидрогеназы такой мутации, которая приводит к экспрессии неактивной пролиндегидрогеназы. Также, бактерия, в которой система деградации L-пролина разрушена, может быть получена выведением штамма с дефицитом способности к усвоению L-пролина и отбора из полученных штаммов штамма, внеклеточно продуцирующего L-пролин, с помощью ауксотрофности по L-пролину в качестве маркера.

Способность к продукции L-аргинина может быть получена, например, приданием устойчивости к α-метилметионину, р-фторфенилаланину, D-аргинину, гидроксамату аргинина, S-(2-аминоэтил)-цистеину, α-метилсерину, β-2-тиенилаланину или сульфагуанидину (выложенная патентная заявка Японии 56-106598) или введением гена argA, кодирующего N-ацетилглутаматсинтазу (выложенная патентная заявка Японии 57-5693).

Способ согласно настоящему изобретению
Способ согласно настоящему изобретению включает в себя выращивание бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, содержащей L-изолейцин, с целью продукции и накопления L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина в питательной среде и выделения L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина из культуральной жидкости.

В качестве питательной среды может быть использована обычная среда, содержащая источник углерода, источник азота, неорганические ионы и другие обычные органические компоненты при условии, что эта питательная среда содержит L-изолейцин. Количество L-изолейцина является таким, чтобы оно было достаточно для того, чтобы предоставлять бактерии согласно настоящему изобретению возможность продуцировать и накапливать L-глутаминовую кислоту, L-пролин или L-аргинин, и составляет обычно от 25 до 250 мг/л.

В качестве источника углерода можно использовать сахара, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза и гидролизат крахмала, спирты, такие как глицерин и сорбит, или органические кислоты, такие как фумаровая, лимонная и янтарная кислоты.

В качестве источника азота можно использовать неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония, органический азот, такой как гидролизат соевых бобов, газообразный или водный аммиак.

Предпочтительно, чтобы в качестве органических питательных добавок в необходимых количествах в среде содержались такие вещества, как витамин B₁ или дрожжевой экстракт. Кроме этого, в небольших количествах добавляются, если необходимо, фосфат калия, сульфат магния, ионы железа, марганца и подобные соединения.

Выращивание проводится предпочтительно в аэробных условиях в течение 16-72 часов. Температура при выращивании поддерживается в пределах от 25^oС до 45^oС, рН - в пределах от 5 до 8. Для поддержания необходимого значения рН могут быть использованы неорганические или органические, кислотные или щелочные соединения, также как и газообразный аммиак или другие подобные вещества.

Культуральная жидкость включает в себя питательную среду и клетки и является предпочтительно питательной средой.

Выделение L-глутаминовой кислоты, L-пролина или L-аргинина из культуральной жидкости может быть осуществлено путем сочетания метода выделения на ионообменной смоле, метода осаждения и других известных методов.

Настоящее изобретение более детально будет разъяснено со ссылкой на следующие примеры.

Пример 1. Получение L-глутаминовой кислоты с использованием штаммов, дефицитных по ilvA.

а) Использование введения транспозона Тn5 (или любого другого) в ген ilvA.

Клетки природного штамма Е. coli К 12 (ВКПМ В-7) были обработаны бактериофагом Р1, который был выращен на клетках ауксотрофного по L-изолейцину штамма Е. coli C600 ilv: :Тn5, содержащего вставку транспозона Тn5 в ген ilvA, и помещены на чашки с агаризованой средой LB, содержащей канамицин (20 мкг/мл), для селекции трансдуктантов, устойчивых к канамицину. В результате было получено производное природного штамма Е. coli К 12, содержащее вставку транспозона Тn5 в ген ilvA. Этот штамм был назван как B7ILE и был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 25 июля 2000 с инвентарным номером ВКПМ В-8013.

б) Конструирование дефицитного по ilvA производного, содержащего мутацию в гене ilvA, из природного штамма Е. coli К 12.

Штамм VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофным по L-изолейцину и L-треонину, так как содержит мутации в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). Природный аллель гена thrC был перенесен методом общей трансдукции с использованием бактериофага P1, выращенного на клетках природного штамма Е. coli К 12 (ВКПМ В-7). В результате был получен ауксотрофный по L-изолейцину штамм VL334thrC⁺.

в) Получение L-глутаминовой кислоты с использованием ауксотрофного по L-изолейцину штамма методом ферментации в пробирке.

Питательная среда для ферментации содержала 60 г/л глюкозы, 25 г/л (NH₄)₂SO₄, 2 г/л КН₂РO₄, 1 г/л MgSO₄, 0,1 мг/л тиамина, 50 мг/л L-изолейцина и 25 г/л мела (рН 7,2). Глюкоза и мел стерилизовались раздельно. 2 Мл питательной среды были помещены в пробирки и инокулированы одной петлей исследуемых микроорганизмов, затем выращивание производилось при 37^oС в течение 2 дней на качалке. Результаты приведены в Таблице 1.

Пример 2. Получение L-пролина с использованием дефицитного по ilvA продуцента L-пролина.

Клетки природного штамма Е. coli К 12 (ВКПМ В-7) были обработаны мутагеном, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (0,1 мг/мл), в течение 20 минут при 37^oС, отмыты и помещены на минимальную агаризованную среду М9, дополненную 1,25 мг/мл триптона, 10 мг/мл L-пролина и 0,05 мг/мл хлорида 2,3,5-трифенилтетразолина. Большинство колоний, выросших после 3 дней инкубации при 37^oС, были окрашены красным. Несколько колоний, не способных окислить L-пролин, были белыми. Одна из этих колоний была использована в качестве исходной для получения мутантов, устойчивых к аналогам пролина (3,4-дегидроксипролин и азетидин-2-карбоксилат), каждый из которых был добавлен в агаризованную среду М9 в концентрации 2 мг/мл.

Некоторые из вырасших мутантов могли продуцировать L-пролин. Наилучший продуцент L-пролина 702 был обработан бактериофагом Р1, выращеным на клетках штамма TG1, в котором ген ilvA был разрушен путем вставки гена устойчивости (Cm^r) к хлорамфениколу (Cm). Один из устойчивых к Cm трансдуктантов, 702ilvA, который стал ауксотрофньм по L-изолейцину, был гораздо более эффективным продуцентом L-пролина, чем исходный прототрофный по L-изолейцину штамм 702 (Таблица 2). Процесс ферментации производился как это указано в Примере 1.

Штаммы 702 и 702ilvA были депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 25 июля 2000 под инвентарными номерами ВКПМ В-8011 и ВКПМ В-8012 соответственно.

Пример 3. Получение L-аргинина с использованием дефицитного по ilvA продуцента L-аргинина.

Штамм 237 - продуцент L-аргинина, который был выведен как мутант, устойчивый к аналогу пиримидина, 6-азаурацилу, содержит вставку транспозона Тn5 в ген ilvA и, следовательно, является ауксотрофном по L-изолейцину. Штамм 237 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 10 апреля 2000 под инвентарным номером ВКПМ В-7925.

Клетки штамма 237 были обработаны бактериофагом Р1, выращеным на клетках природного штамма К 12 (ВКПМ В-7), и выбран трансформант, прототрофный по L-изолейцину. Продукция L-аргинина всеми прототрофными по L-изолейцину трансдуктантами была радикально понижена (Таблица 3). Процесс ферментации производился как это указано в Примере 1.

Изобретение относится к биотехнологии. Аминокислоты семейства L-глутаминовой кислоты, а именно L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин получают культивированием бактерии Escherichia coli, ауксотрофной по L-изолейцину. Бактерию культивируют в питательной среде, содержащей L-изолейцин. После накопления аминокислот семейства L-глутаминовой кислоты их выделяют из культуральной жидкости. Штамм Escherichia coli VL322thrC⁺ продуцирует L-глутаминовую кислоту, штамм E. coli 702ilvA (ВКПМ В-8012) продуцирует L-пролин, а штамм E. coli 237 (ВКПМ В-7925) продуцирует L-аргинин. Данное изобретение позволяет получить более высокий выход аминокислот семейства L-глутаминовой кислоты при использовании ауксотрофной по L-изолейцину бактерии Е. соli. 4 c. и 6 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения L-аминокислоты семейства L-глутаминовой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia coli - продуцента L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют бактерию Escherichia coli, ауксотрофную по L-изолейцину. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что L-аминокислота представляет собой L-глутаминовую кислоту, L-пролин или L-аргинин. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют бактерию Escherichia coli, дефицитную по активности одного из ферментов биосинтеза L-изолейцина. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что такая бактерия является дефицитной по активности треониндеаминазы. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве продуцента L-глутаминовой кислоты используют штамм Escherichia coli VL322thrC⁺. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве продуцента L-пролина используют штамм Escherichia coli 702ilvA (ВКПМ В-8012). 7. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве продуцента L-аргинина используют штамм Escherichia coli 237 (ВКПМ В-7925). 8. Штамм Escherichia coli VL322thrC⁺ - продуцент L-глутаминовой кислоты. 9. Штамм Escherichia coli 702ilvA (ВКПМ В-8012) - продуцент L-пролина. 10. Штамм Escherichia coli 237 (ВКПМ В-7925) - продуцент L-аргинина.