ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES EUTROPHUS - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКОВОЙ БИОМАССЫ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма-продуцента белковой биомассы.

Известны микробиологические способы получения белковой биомассы на гидролизатах растительного сырья и отходах целлюлозно-бумажной промышленности, а также на n-парафинах нефти [1-5]
Недостатками способов являются низкие скорости роста продуцентов (0,20-0,25 с^-1), не высокие концентрации белка в биомассе (40-55%), а также ограниченность сырьевой базы в целом.

Известны продуценты биомассы на водороде Hydrogenomonas thermophilus K-2 [6] а также белковых веществ Alcaligenes eutrophus Z-1 [7] Микробиологический синтез белка на водороде характеризуется высокими скоростями роста продуцентов и выходами белка, отсутствием токсичных отходов и побочных продуктов, не зависит от дефицитного органического сырья, позволяет получать продукт высокой чистоты. Процесс можно ориентировать на различные доступные и дешевые источники водорода, включая водородсодержащие индустриальные газовые выбросы. Для бактерий H. thermophilus Л-2 максимальный выход биомассы составляет при росте на водороде 1,5-2,0 г/л, максимальное развитие организма происходит за 24 ч. Штамм A. eutrophus Z-1 имеет следующие характеристики: лаг-фаза при росте на водороде составляет 24-28 ч, максимальный урожай 60- часовой культуры 2,9-3,1 г/л продуктивность в линейной фазе роста 0,06-0,10 г/л· ч, содержание белка в биомассе 50-60% но к стационарной фазе оно падает до 23% [7]
Недостатками данных штаммов являются низкие значения общей продуктивности и выхода биомассы.

Известен штамм Calderobacterium hydrogenophilum продуцент гидрогеназы, а также возможный источник кормового белка [8] Штамм наиболее близок к предлагаемому, так как может быть источником белковых веществ, имея следующие характеристики при росте на водороде при 76^оС: максимальные значения удельной скорости роста 0,4 ч^-1, время генерации 2 ч, концентрация белка в биомассе 60% содержание аминокислот 36%
Недостатком штамма является низкое содержание аминокислот, а также необходимость стабилизировать температуру культивирования на высоких значениях, что существенно усложняет технологию и требует специального термостойкого оборудования и значительных энергозатрат.

Цель изобретения выявление нового штамма, растущего на водороде, более эффективно синтезирующего высокобелковую биомассу не в экстремальных условиях.

Предлагаемый штамм является одним из вариантов, выделенных из культуры Alcaligenes eutrophus Z-1 в процессе длительной многоступенчатой селекции по скорости роста и синтезу белка. Использована стандартная процедура последовательных пересевов культур на плотные среды с поэтапным отбором колоний, образованных клетками с максимальными значениями скорости роста и содержания белка.

Штамм Alcaligenes eutrophus депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов Института "ВНИИгенетика", коллекционный номер ВКПМ В-5786.

Морфологические признаки штамма. Клетки палочки (молодые короткие, в стационарной фазе разной длины, размеры 0,3-0,5х1,2-2,0 мкм, грамотрицательные, подвижные (молодые монотрики), с возрастом перетрихи). На агаризованной среде с пептоном (гетеротрофные условия роста) образуют округлые колонии, кремовато-серого цвета, с возрастом коричневеющие, размер колоний 1,5-5,0 мм. На минеральной агаризованной среде (автотрофные условия роста) колонии мелкие, светло-серые, полупрозрачные. В жидких средах рост диффузный.

Культурально-морфологические признаки штамма стабильно сохраняются при варьировании условий культивирования и сред.

Вариант 1. Штамм A. tutrophus B-5786 выращивали в периодической автотрофной культуре. Жидкая солевая среда Шлегеля содержит Na₂HPO₄ · 9H₂O 9,5 KH₂PO₄ 1,5 MgSO₄ 0,2 CO(NH₂)₂ 1,5 а также 5 мл раствора железа лимоннокислого (5 г/л) и 3 мл стандартного раствора микроэлементов, содержащего, г/л: H₃BO₃ 0,228 CоCl₂ · 6 H₂O 0,030 CuSO₄ · 5 H₂O 0,008 MnCl₂ · 4 H₂O 0,008
ZnSO₄ · 7 H₂O 0,176 NaMoO₄ · 2 H₂O 0,008 NiCl₂ 0,008
Культивирование осуществляли в стеклянной 2- литровой колбе, заполненной 0,5 л среды, инокулированной музейной культурой предлагаемого штамма.

Исходная концентрация клеток в культуре 0,5 г/л. Колба соединена с газометром, заполненном газами, об. водород 70,0; кислород, 20,0; двуокись углерода 10,0. Культивирование проводили в течение 38 ч при 30^оС и pH 7,0. Периодически, через 6-8 ч, газовая среда в колбе обновляется (с помощью вакуумного насоса газовая смесь эвакуируется из колбы и поступает свежая смесь), в результате состав газов в культуре мало изменяется от установленной нормы. Удельная скорость роста бактерий в линейной фазе составляет 0,41 ч^-1, продуктивность 1,5-2,0 г/л· ч, концентрация белка в клетках 68% сумма аминокислоты 65% при высеве на агаризованную среду колонии образуются на третьи сутки: округлые серовато-кремовые, клетки короткие палочки, 0,3-0,5х1,0-1,2 мкм, подвижные, в основном монотрихи.

Вариант 2. Штамм выращивали в проточной культуре в ферментере объемом 2 л с заполнением культурной 0,5 л при стабилизации pH (7,0), температуры (30^оС) при скорости прокачки газовой смеси через культуру, равной 4 л/мин· л. Состав газовой смеси, об. кислород 16 ± 3; двуокись углерода 9 ± 1; водород остальное, до 100. Концентрация клеток в культуре в установившемся режиме составляла 2,0 ± 0,15 г/л. Основа жидкой солевой среды аналогично варианту 1, но с уменьшенным содержанием фосфатов, соответственно, для натрия фосфорнокислого и калия фосфорнокислого 4,5 и 0,75 г/л. Культивирование в системе pH-статирования, корректирующий раствор 0,1 М КОН. Цикл непрерывного культивирования 100 ч при следующих характеристиках: удельная скорость роста бактерий 0,41 ч^-1, концентрация белка и аминокислот в клетках, соответственно, 70 и 65% Популяция на 90% представлена активно делящимися молодыми клетками: короткие палочки, 0,3-0,5х1,0-1,2 мкм монотрихи.

Вариант 3. Штамм культивировали в проточно-плотностатной культуре. Жидкая солевая среда готовится на основе кислот и щелочей, используют следующие растворы: КОН 30% кислота ортофосфорная (плотность 1,69), NaOH 20% источник азота мочевина в концентрации 1 г/л. Приготовление среды: на 1 л дистиллированной воды вносят 0,5 г MgSO₄, 2 мл раствора KОН, 2 мл концентрированной ортофосфорной кислоты (железо и микроэлементы аналогично вариантам 1 и 2). Исходное pH среды с помощью подтитровки раствором NaOH доводят до 6,5-6,7. В процессе ферментации мочевина под воздействием бактериальной уреазы гидролизуется и pH стабилизируется на уровне 7,0 ± 0,1. Температура культивирования 30^оС, объем ферментера составляет 8 л, объем культуры 2 л, длительность цикла ферментации не менее 200 ч в установившемся режиме при следующих характеристиках: концентрация клеток в культуре 3,0 ± 0,15 г/л, удельная скорость роста бактерий 0,43 ± 0,01 ч^-1, скорость прокачки газа через культуру 8 л/мин на л (состав газов аналогично варианту 2). Продуктивность культуры 2,4 ± 0,15 г/л· ч, концентрация белка и аминокислот в биомассе, соответственно, 70 и 65% Клетки короткие коккоподобные палочки, размер 0,3-0,5х1,0 мкм, монотрихи.

Физиолого-биохимические свойства. Штамм облигатный аэроб, сахара не усваивает, кроме фруктозы, Штамм обладает широким органотрофным потенциалом и способен в качестве источника углерода использовать: аминокислоты (аланин, серин, лейцин, гистидин, триптофан, глутаминовую, аспарагиновую, лизин), органические кислоты (щавелевую, лимонную, янтарную, фумаровую, уксусную, валериановую), спирты (этанол, глицерин), а также окись углерода.

В качестве источника азота штамм усваивает минеральные и органические соединения: NH₄OH, NH₄Cl, NH₃, KNO₃, NH₄NO₃, CO(NH₂)₂. В массовой проточной культуре лучшими являются восстановленные формы азота хлористый аммоний и мочевина, однако применение первого требует дополнительных мер для стабилизации pH среды на уровне оптимальном для роста бактерий. На нитратах скорость роста штамма ниже на 30-35% Из органических соединений помимо названных аминокислот штамм усваивает мочевую и гиппуровую кислоты, креатинин, аллантоин.

Гидролитическими ферментами штамм не обладает, желатину не разжижает, крахмал не гидролизует. На минеральной среде в атмосфере водорода, двуокиси углерода и кислорода специфических факторов роста и органических добавок не требуется. Границы физиологического действия pH для штамма в диапазоне 4,4-8,6, оптимальны для скорости роста значения pH 6,5-7,2, сдвиг pH в кислую сторону на одну единицу снижает скорость роста практически в 2 раза. щелочная среда ингибирует рост более значительно, при pH 8,0 удельная скорость роста не превышает 0,22 ч^-1.

Способность к росту штамм сохраняет в диапазоне температур 20-41^оС, оптимум для размножения 29,5-32,0^оС. Максимальная температурная точка для штамма 41^оС, выше рост прекращается. Минимальная точка в периодической экстенсивной культуре составляет 20^оС, в проточной культуре 22^оС.

Содержание ГЦ пар нуклеотидов в ДНК равно 66%
При оптимальных условиях роста удельная скорость роста штамма составляет 0,41-0,45 ч^-1, содержание белка в биомассе 65-67% содержание аминокислот 65% время генерации 1,5 ч, продуктивность 2 г/л· ч, белоксинтезирующая активность составляет 2,4-2,9 мг белка/мг РНК в час.

Штамм стабильно сохраняет свои свойства, устойчив в фаголизису и контаминации, это позволяет проводить незащищенную ферментацию в автотрофных условиях роста.

Хранение культуры осуществляется обычными способами: на косяках агаризованной среды Шлегеля и в лиофилизированном состоянии в запаянных стеклянных ампулах при 3-5^оС. Частота пересовов косяков через 30-35 сут.

П р и м е р 1. Штамм Alcaligenes eutrophus ВКПМ В-5786 поддерживают на скошенной агаризованной среде Шлегеля в атмосфере смеси газов (водород:кислород:двуокись углерода-7:2:1). На поверхность скошенного агара наносят культуру штамма, пробирки помещают в эксикатор с герметически притертой крышкой, воздух эвакуируют, эксикатор, заполняют смесью газов вышеназванного состава. Пробирки, помещенные в эксикаторе, размещаются в термостатируемом шкафу при 30^оС, инкубирование 7 сут.

Приготовление жидкой солевой среды для автотрофного выращивания штамма.

Раствор А среда Шлегеля, г/л: Na₂HPO₄ · 9 H₂O 9,5 KH₂PO₄ 1,5 MgSO₄ 0,2 CO(NH₂)₂ 1,5
Раствор Б железо лимоннокислое FeNH₄C₆H₅O₇ 5 г/л.

Раствор В микроэлементы по прописи Хоагланда, мкг/мл: H₃BO₃ 228 CoCl₂ · 6 H₂O 30 CuSO₄ · 5 H₂O 8 MnCl₂ · 4 H₂O 8 ZnSO₄ · 7 H₂O 176 NaMO₄ · 2 H₂O 50 NiCl₂ 8
Растворы А, Б и В готовят и стерилизуют отдельно. Перед засевом к 1 л раствора А добавляют, соответственно, 5 и 3 мл pаствоpов Б и В. Для получения плотной среды к 1 л полученной солевой среды добавляют 20 г агара (стерилизация при 1 атм).

Клеточную массу смывают с поверхности косяков, выросших в эксикаторе, жидкой средой названного состава, смывом инокулируют 0,1 л среды, разлитой в конические колбы объемом 0,5 л (исходная оптическая плотность культуры 0,1 ед. при λ460 нм). Колбы соединяют герметично с газовой емкостью, содержащей водород, кислород и двуокись углерода в названном выше соотношении и размещают в термостатируемой качалке при 30^оС на 42 ч до получения культуры с оптической плотностью 1,0 -1,5 ед. Лаг-фаза составляет 12-18 ч, удельная скорость роста культуры 0,42 ± 0,01 ч^-1, продуктивность 1,5 г/л· ч, концентрация белка и аминокислот в клетках 70 и 65% соответственно.

П р и м е р 2. С поверхности косяка музейной культуры приготавливают смыв аналогично примеру 1. Смывом инокулируют 0,5 л жидкой солевой среды того же состава, среда вносится в 2- литровые колбы, соединенные герметично с емкостью, содержащей газы известного состава (пример 1), колбы размещают на магнитной мешалке ММ-3. Инкубирование проводят в течение 3 сут. при 30^оС. Удельная скорость роста бактерий составляет 0,41 ч^-1, содержание белка и аминокислот в клетках 69 и 65%

Использование: промышленная микробиология. Сущность изобретения: выявление нового штамма Alcal genes eutrophus SV - продуцента белковой биомассы. Проводят многоступенчатую селекцию по скорости роста и синтезу белка. Штамм Alcaliegenes eutrophus SV - продуцент биомассы, обладает высокой скоростью роста 0,43 ± 0,02 ч^- 1, содержание белка в биомассе 65 - 67%, содержание аминокислот 65%, время генерации 1,5 ч, продуктивность 2 г/л ч, белкосинтезирующая активность 2,4 - 2,9 мг белка/мг РНК/ч.

Штамм бактерий Alcaligenes eutrophus ВКПМ В-5786 - продуцент белковой биомассы.