Штамм бактерий ALCALIGENES EUTROPHUS - продуцент НАД-зависимой гидрогеназы Советский патент 1993 года по МПК C12N1/20 C12N9/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению ферментов микробного происхождения, а именно к получению НАД-зави- симых гидрогеназ.

Известен штамм Alcaligenes eutrophus Z-1. являющийся продуцентом НАД-зави- симой гидрогеназы. Активность фермента составляет 8-9 мкмоль НАДН/мин/мг белка (2). Недостатком данного штамма является невысокая активность фермента - НАД-зависимой гидрогеназы.

Целью изобретения является штамм-активный продуцент НАД-зависимой гидрогеНЗЗ.Ы.

Указанная цель достигается аэробной факультативной хемолитоавтотрофной ме- зофильной водородокисляющей бактерией Alcaligenes eutrophus ИНМИ 2-101, депони- рованной в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИге- нетики под номером В-3354.

Предлагаемый штамм получен путем длительной селекции исходного штамма А. eutrophus Z-1 в условиях хемолитоавтот- рофного роста (культивирование на жидкой минеральной среде в атмосфере газовой смеси из водорода, кислорода и углекислого газа). Культивирование проводят в стационарных условиях или путем ферментации, осуществляемых в периодическом или проточном режиме, с удалением отработанного газа и без удаления его. В результате проведенной селекции предлагаемый штамм А. eutrophus изменил свой потенциал используемых органических субстратов и существенно повысил активность ключевого фермента метаболизма водорода: НАД-зависимой гидрогеназы. Удельная активность НАД-зависимой гидрогеназы этого организма составляет 17 мкмоль НАДН/мин/мг белка в грубых экстрактах клеток,

Культурально-морфологические признаки: клетки штамма A. eutrophus Z-101 представляют собой средней величины гра- мотрицательные палочки 0,35-0,5x2,5 мкм, часто в коротких цепочках. В молодых культурах клетки имеют 1-2 жгутика, у более старых культур отмечается перетрихиаль- ный тип жгутмкования. Размножаются клетки делением пополам, слизи не образуют. На агаризованных экстрактивных средах организм образует серовато-белые плоские со слегка приподнятым центром и лопастным краем колонии. На агаризованной минеральной среде колонии округлые, блестящие, непигментированные. В хемо- литоавтотрофных условиях, т. е. в атмосфере газовой смеси из 75% Нз, 15% 02 и 10% СОа на жидкой минеральной среде, рост

диффузный. Организм лучше растет при перемешивании жидкой среды, чем в стационарных условиях. Суспензия клеток молочно-белая, в старых культурах ксричневато-розовая. Оптимальная температура роста 28-30°С.

Физиолого-биохимические признаки: предлагаемый организм является факульта- тивным хемолитоагготрофом, т. в. способен

расти как за счет аэробного окисления водорода, используя углекислоту в качестве единственного источника углерода, так и ор- ганотрофно, используя разнообразные органические соединения. Сахара не

5 сбраживает. На среде с нитратом возможна анаэробная денитрификация. Нитрат восстанавливает с накоплением нитрита. Гидролитическими ферментами не обладает: желатину не разжижает, крахмал не гидро0 лизует. Углеводы сначала не использовались, но в процессе лабораторного культивирования появилась способность расти ка фруктозе, а также был получен мутант, растущий на глюкозе. Однако, араби5 ноза, галактоза, ксилоза, лактоза, манноза, рибоза, сахароза и другие из проверенных углеводов оставались недоступными для данной культуры. Лучше всего используются органические кислоты и аминокислоты,

0 спирты не используются совсем. Организм может расти на ароматических соединениях, включая фенол, бензоат, тестостерон, мета- и параоксибензойную кислоты. При проверке на чувствительность к антибиоти5 кам было установлено, что часть из них, например тетрациклин или карбенциллин, ингибируют развитие организма, другие (такие как ампицилин, бензилпенициллин, ген- тамицин, рифампицин, стрептомицин) на

0 него не действуют. В качестве источника азота используют аммоний, нитрат, нитрит, аминокислоты, амины, мочевину, целый ряд азотистых оснований.

Лабораторные исследования, проводи5 мые в течение ряда лете A. eutrophus Z-101, показали, что для сохранения высокой гид- рогеназной активности у этого организма его необходимо поддерживать в условиях автотрофного роста, хранение организма в

0 гетеротрофных условиях (пассажи на экстрактивных средах или средах с другими органическими субстратами) неминуемо приводит к резкому снижению активности НАД-зависимой гидрогенэзы.

5

Штамм Aicalfgenes eutrophus Z-101 для получения из него НАД-зависимой гидрогеназы выращивают на минеральной среде Шлегеля следующего состава, г/л: Na2HP04-12HaO 4.5: 0,75;

NH4CI 2,0; MgSCM 0.20; CaCI2 0.02, Fe{NH4)C6H507 0,012: МаНСОз 0,5. Вода дистиллированная 1000 мл, рН среды 6,,1. В срезу добавляются микроэлементы в количестве 2 мл/л. Смесь микроэлементов Хо- агланда на 200 мл Н2О содержит, мг: НзВОз 22,8; CoCl2 -6Н20 8,0; CuSO 5Н20 0,8; MnCl2 -7Н20 0.8: ZnS04 -7Н20 1,76: Na2Mo04 -2H20 5,0; 0,8. Газовая фаза состоит из 75-80% Н2, 10-15% 02 и 10% С02. В факторах роста культура не нуждается. Оптимальная для роста температура 28|зо°с.

Периодический способ культивирования является наиболее приемлемым для получения автотрофной биомассы А. eutrophus - продуцента НАД-зависимой гидрогеназы. Причем максимум активности этого фермента приходится на конец линейной фазы роста предлагаемого организма.

Следующим этапом подготовки культуры A. eutrophus для получения из нее активной НАД-зависимой гидрогенэзы является наращивание организма по способу, описанному для бактерии - прототипа 2, где в качестве субстрата и источника углерода используют цитрат натрия в концентрации 0,2-0,3 мол.%, а также глицерин в концентрации 0,2-0,3 об.%. вводимый в питательную среду в начале стационарной фазы роста. Вместо цитрата Na можно использовать также и фруктозу в концентрации 0,2- 0,3 мол.%, которая является более дорогим сырьем, но применение ее способствует (получению фермента с более высокой (удельной активностью. Наращивание биомассы A. eutrophus на |среде с цитратом и глицерином осуществля- |ют или на качалке в 2- /литровых колбах, наполовину заполненных средой, или вфер- (ментерах FL Blotec и АК-3-1. I Определение НАД-зависимой гидрогена- (зы производят спектрофотометрически на jSpecord M-40 при длине волны 340 нм. Мож- но определять при температуре 25° и 37°С. Удельная активность гидрогеназы, вы- |деляемой из A. eutrophus Z-101, возрастает Jpo мере роста культуры. Максимальная удельная активность фермента отмечается в конце линейной фазы роста. При переходе культуры на стационарную фазу удельная |активность снижается на 50% от максимальной, также значительно более низкой (является она в начальной фазе автотрофно- )го роста культуры. I Пример 1. Культуру выращивают втотрофно в ферментере с рабочим обье- мом Зл (загрузка 100%:34% - жидкая среда: 66% - газовое питание). Используют минеральную среду следующего состава. г/л:Ма2НР04-12Н20 4,5; КН2Р04 0.75; NHaCt 2.0; MgS04 7H20 0.20; CaCI 0.02: Fe-аммиачное лимоннокислое 0,012: NaHCOsO.50. Вода дистиллированная 1000 мл, рН среды 7,0.

В среду добавляют микроэлементы Хо- агланда в количестве 2 мл/л.

Газовое питание для культуры подают из баллонов через систему редукторов. Используется газовая смесь состава: На Р0%, 02 10%, С02 10%. Скорость продувки этой смесью составляет 500 мл/мин. Скорость перемешивания 350 об/мин. Ферментация идет при температуре 28°С. В конце фазы линейного роста продувку культуры прекращают и еще сутки ее выдерживают в условиях недостаточного газового питания. Затем значительную часть культуры сливают, а оставшуюся часть (примерно 2-3 об.%) используют в качестве инокулята для ферментации того же организма на среде с цитратом натрия (цитрат дается по фону минеральной среды в количестве 2 г/л). Культивирование проводят в том же ферментере в периодических условиях при аэрации. В начале стационарной фазы роста, когда источник углерода - цитрат-ион - в среде исчерпывается (через.28 ч), в среду добавляют 0,2 об.% глицерина и продолжают-культивирование еще 36 ч. По окончании культивирования клетки осаждают на центрифуге при 5000 об/мин. Активность НАД-зависимой гидрогеназы определяют спектрофотометрически по скорости образования НАДН. Удельная активность гидрогеназы в грубых экстрактах клеток составляет в этом случае 17 мкмоль НАДН/мин/мг белка.

Пример 2. Культуру выращивают в автотрофных условиях согласно примеру 1 до конца фазы линейного роста. В отличие от примера 1 продувку газовой смесью из 80% Н2, 10% 02 и 10% С02 не прекращают весь период роста культуры. Для инокулиро- вания среды с цитратом натрия берут авто- трофную культуру, находящуюся в стационарной фазе роста (через 42 ч с начала культивирования). Далее культивирование проводится снова согласно примеру 1. По окончании роста культуры на среде с цитратом и глицерином определяется активность НАД-зависимой гидрогенэзы описанным выше способом.. В этих условиях удельная активность фернэнта составляет 13 мкмоль НАДН/мин/мг белка.

НАД-зависимая гидрогеназа из Alcallgenes eutrophus представляет собой сложный олигомерный полифункциональный фермент, играющий важнейшую роль в

метаболизме этого водородЬкисляющего организма. Физиологическая роль этого фермента заключается в обеспечении клетки универсальным восстановительным эквивалентом - НАДН.

Использование данного штамма позволяет получать в 2 раза более активную НАД- зависимую гидрогеназу.

НАД-зависимая гидрогенэза является перспективным продуктом для ряда областей биотехнологии. Ферменты этой группы способны заменить существующие в настоящее время катализаторы на основе благородных металлов и рассматриваются,

например, как ключевые биокатализаторы в системах биоконверсии, тонком органическом синтезе, а также процессах, реализующих реакции изотопного обмена. Преимуществом использования НАД-зави- симой гидрогеназы является отсутствие побочных продуктов а катализируемой реакции, что существенно упрощает проблему очистки целевого продукта.

(56)1. Авторское свидетельство СССР № 1125245, кл. С 12 N 9/02, 1984.

2.Авторское свидетельство СССР № 1336569, кл. С 12 N 9/04. 1987.

Ф о р м у з о б р е те ни я Штамм бактерий Alcallgenes eutrophus

ВКПМ В-3354 - продуцент НАД - зависи- .мой гидрогеназы.