ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/21 C12N15/53 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению штамма продуцента бактериальной люциферазы.

Указанный фермент применяется для аналитического определения никотинамидадениндинуклеотидов и ферментов, использующих их в качестве субстратов. Поэтому получение люциферазы в препаративных количествах имеет важное значение для целей медицинской биохимии, микробиологии и экологии.

Известен природный штамм-продуцент люциферазы Photobacterium leiognathi, содержание люциферазы в котором составляет до 5% от растворимого белка. Поэтому для получения люциферазы в препаративном количестве требуется много бактериальной биомассы.

Целью изобретения является получение рекомбинантного штамма Escherichia coli, продуцирующего высокоактивную люциферазу Photobacterium leiognathi.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве штамма-продуцента использован рекомбинантный штамм Escherichia coli SL60, в котором клонированы гены Lux A, B Photobacterium leiognathi в составе единого фрагмента ДНК, ограниченного сайтами рестрикции Есо 47III Hin 1.I под контролем Lac промотора векторной плазмиды pUC18.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института "ВНИИгенетика" под регистрационным номером ВКПМ В-5520.

Рекомбинантный штамм Escherichia coli SL60 обладает следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, размеры (1 2)х(3 6) мкм, подвижные, не образуют эндоспор. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПБ) при температуре 37^oC. Колонии на СПА округлые, края ровные, четкие.

Физиолого-биохимические признаки. Грамотрицателен, не сбраживает лактозу и арабинозу, ауксотроф по тиамину и пролину, обладает устойчивостью к ампициллину в концентрациях до 50 мг/л.

Хранение штамма осуществляют в 30%-ном глицерине при -70^oC.

Биотехнологические свойства. При исследовании разрушенной биомассы из нее выделена люцифераза, по специфической активности и электрофоретической подвижности подобная люциферазе Photobacterium leiognathi.

Определяющим отличием предлагаемого штамма Escherichia coli SL60 является высокое содержание люциферазы, составляющее до 50% от растворимого белка (в 10 раз выше, чем у штамма-прототипа).

Пример. Получение биомассы и выделение фермента.

Штамм-продуцент Е. соli SL60 выращивают на жидкой питательной среде LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л хлористого натрия), содержащей антибиотик ампициллин (50 мг/л), при температуре 37^oC до плотности клеточной суспензии 2 4 опт. ед. (λ 550 нм). Клетки отделяют от среды центрифугированием, осадок промывают 100 мкМ К-Na-фосфатным буфером (рН 7,0) и взвешивают. Для получения люциферазы 2 г сырой биомассы суспендируют в этом же буфере из расчета 10 мл буфера на 1 г биомассы. Клетки разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т импульсами по 20 секунд с 10-секундными интервалами. Общая продолжительность обработки составляет 3 минуты. Клеточные обломки удаляют центрифугированием при 20000g в течение 30 минут. Супернатант, содержащий люциферазу, наносят на колонку Моno Q (1 х 10 см) в системе FPLC (Pharmacia, Швеция), уравновешенную 0,01 М К-Na-фосфатным буфером (рН 7,0). Скорость нанесения составляет 2 4 мл/мин. После нанесения колонку промывают 0,1 М раствором NaCl и элюируют люциферазу линейным градиентом NaCl в пределах концентраций 0,2 0,4 М. Объем собираемых фракций составляет 2 мл. Люцифераза выходит в объеме 8 10 мл в пределах 0,3 0,36 М NaCl. Хроматографические процедуры проводят при комнатной температуре.

Выход фермента составляет до 95% от начального количества.

Активность полученного препарата измеряли по методике, описанной в известной работе. Активность полученного препарата люциферазы с миристиновым альдегидом и ФМНН₂ составила 2,5 х 10¹⁵ квант с^-1мг^-1.

Изобретение относится к биотехнологии. Сущность изобретения: штамм получен клонированием генов Lux A, B Photobacterium leiognathi, кодирующих α и β субъединицы люциферазы в Escherichia coli. Штамм хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института "ВНИИгенетика" под регистрационным номером ВКПМ В-5520. Штамм продуцирует люциферазу, содержание которой составляет до 50% от растворимого белка, и может полностью заменить прототип в получении фермента для биотехнологических целей.

Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-5520 продуцент бактериальной люциферазы.