СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И КАРОТИНОИДОВ В ПЕЛОИДАХ Российский патент 2003 года по МПК A61K35/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к бальнеологии.

Известен способ определения суммы липидов и каротиноидов (ФС 42-2917-92 и ТУ 9310-003-04710595-95), заключающийся в экстракции сухой измельченной грязи смесью 95%-ного спирта и эфира (1:5) с последующим определением липидов по весу, и каротиноидов на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 нм в кювете толщиной 5 мм, с параллельным определением оптической плотности стандартного раствора бихромата калия, 1 мл которого соответствует раствору 0,00208 мг бета-каротина.

Для данного метода характерны следующие недостатки:
1. В процессе высушивания грязи и последующего измельчения в порошок теряется естественный антиоксидант - сероводород и происходит разрушение и окисление части каротиноидов, их содержание значительно уменьшается в воздушно-сухой грязи по сравнению с сырой.

2. Определение липидов в высушенном остатке первичного спиртоэфирэфирного экстракта неточно, так как в нем присутствуют минеральные соли и свободная сера, завышающие количество липидов.

3. Спиртоэфирная смесь не удобна для экстракции, так как легко воспламеняется и легколетуча.

4. Стандартизация грязи осуществляется по - содержанию каротиноидов, но спиртоэфирэфирные, спиртоэфирхлороформенные смеси экстрагируют каротиноиды в меньшей степени, чем такой растворитель как ацетон, стандартно применяющийся для экстракции пигментов в биохимии растений (рисунок).

5. По литературным данным (Справочник биохимика: Пер. с англ./ Доссон Р. и др. - М. : Мир. 1991 - с. 196) и при изучении спектра 0,2 мг% раствора бета-каротина максимум поглощения наблюдается в области длин волн 440-460 нм, а не при 400 нм, рекомендованных в старой методике количественного определения (рисунок).

Отличие предлагаемого способа заключается в том, что проводится исчерпывающая экстракция ацетоном липидного комплекса с каротиноидами из нативной грязи в аппарате Сокслета, измерение оптической плотности экстракта при длине волны 450 нм на КФК-3 в кювете толщиной 10 мм и использование для расчета содержания каротиноидов известного по литературным данным (Справочник биохимика: Пер. с англ./Доссон Р. и др. - М.: Мир. 1991 - с.196) удельного показателя поглощения (2250), численно равного оптической плотности однопроцентного раствора бета-каротина при длине оптического пути = 1 см.

Для определения липидов аликвотная часть экстракта упаривается в фарфоровой чашке и взвешивается. Остаток отмывается хлороформом (удаление липидного комплекса), просушивается и чашка вновь взвешивается. По разнице первого и второго взвешивания определяется содержание липидного комплекса.

Способ осуществляется следующим образом.

Около 10 г (точная навеска) нативной грязи взвешивают в фарфоровой чашке объемом 50 мл. К навеске грязи приливают 20-30 мл ацетона марки хч, размешивают грязь с ацетоном стеклянной палочкой и количественно, промывая чашку ацетоном, переносят в патрон из фильтровальной бумаги, который заранее помещают в аппарат Сокслета емкостью 250 мл. Когда навеска полностью перенесена в патрон, его сверху закрывают крышкой из такой же фильтровальной бумаги. Вставляют в аппарат Сокслета водяной холодильник, доливают в него ацетон до слива и нагревают водяную баню через реле с контактным термометром до кипения ацетона, производят исчерпывающую экстракцию из нативной грязи липидного комплекса с каротиноидами.

Полученный ацетоновый экстракт с липидным комплексом упаривают до объема 20-30 мл, количественно переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки ацетоном (первый экстракт). 5 мл полученного экстракта вносят в мерную колбу на 25 мл, доводят до метки ацетоном и колориметрируют, например, на фотометре КФК-3 при длине волны 450 нм в кювете толщиной 10 мм. Содержание каротиноидов определяют по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
2550 - удельный показатель поглощения, численно равный оптической плотности однопроцентного раствора бета-каротина при длине оптического пути = 1 см;
V₁ - объем растворителя, взятого для растворения липидного комплекса, мл;
V₂ - объем экстракта липидного комплекса, взятого для разведения, мл;
V₃ - объем разведенного экстракта липидного комплекса, мл;
а - навеска нативной грязи, г;
1000 - пересчет количества каротиноидов, мг%.

Аликвотную часть 1-го экстракта отбирают пипеткой на 25 мл и упаривают во взвешенной фарфоровой чашке емкостью 50 мл досуха, сушат при 60-90^oС до постоянного веса. Остаток сухого экстракта взвешивают, липидную фракцию отмывают 10-20 мл хлороформа до получения бесцветного раствора, который декантируют с осадка минеральных солей и серы. Оставшийся в чашке осадок сушат при 60^oС до постоянного веса.

Содержание липидов определяют по формуле:

где а - навеска нативной грязи, г;
b - вес аликвотной части ацетонового экстракта, г;
с - вес минеральных солей и серы, полученных из той же аликвотной части ацетонового экстракта, г;
V₁ - объем экстракта липидного комплекса, мл;
V₂ - объем аликвотной части экстракта, взятый для определения содержания липидов, мл.

Содержание липидного комплекса в нативной грязи должно быть не менее 0,3%.

Содержание суммы каротиноидов (в пересчете на бета-каротин) должен быть не менее 1 мг%.

Таким образом, расчет количественного содержания каротиноидов значительно упрощается, повышается точность определения и достоверность результатов.

Способ может быть проиллюстрирована следующим примером.

Была исследована способность следующих растворителей и смесей для экстракции липидного комплекса из сырой грязи: ацетон, 96% этанол, смесь 96% этанола с хлороформом (1:1), 96% этанола с эфиром (1:5), ацетонитрил. Подготовка извлечений осуществлялась следующим образом: 5,0 г нативной грязи заливали 25 мл вышеперечисленными растворителями и их смесями, после 30-минутного встряхивания каждый экстракт отфильтровывали в мерные колбочки на 25 мл и доводили до метки. 5 мл каждого извлечения разводили соответствующим экстрагентом в соотношении 1:5, и в полученных растворах снимали спектры для установления максимума оптической плотности и определения оптимального для экстракции экстрагента при одинаковых условиях экстракции.

Спектры поглощения ацетонового, спиртового, спиртоэфирхлороформенного экстрактов представлены на чертеже, одновременно на этом же чертеже представлены спектры 0,36 г/л водного раствора бихромата калия, рекомендованного старой методикой, как раствор сравнения и 0,2 мг% раствора бета-каротина. Как видно на чертеже, максимум экстинкции 0,2 мг% раствора бета-каротина соответствует длине волны 440-460 нм, что характерно и для исследованных экстрактов. Незначительное превышение пиков в области 420 нм для ацетонового и спиртохлороформного экстрактов можно объяснить большим извлечением этими экстрагентами хлорофиллов. Максимум экстинкции для 0,36 г/л водного раствора бихромата калия соответствует длине волны 390 нм, а в области 450 нм он значительно меньше.

В результате исследования установлено, что ацетон по сравнению с другими экстрагентами при одинаковых условиях экстракции (соотношении сырья и экстрагента 1:5, времени экстракции 30 мин и одной и той температуре 25^oС) извлекает из сырой грязи большее количество каротиноидов, чем другие экстрагенты. Таким образом, он является оптимальным для экстракции каротиноидов из нативной грязи.

Далее приводится непосредственный способ определения липидов и каротиноидов в пробе иловой сульфидной Тамбуканской грязи.

Точную навеску в 10,00 г нативной грязи взвешивают в фарфоровой чашке объемом 50 мл. К навеске грязи приливают 20-30 мл ацетона марки хч, размешивают грязь с ацетоном стеклянной палочкой и количественно, промывая чашку ацетоном, переносят в патрон из фильтровальной бумаги, который заранее помещают в аппарат Сокслета емкостью 250 мл. Когда навеска полностью перенесена в патрон, его сверху закрывают крышкой из такой же фильтровальной бумаги. Вставляют в аппарат Сокслета водяной холодильник, доливают в него ацетон до слива и нагревают водяную баню через реле с контактным термометром до кипения ацетона, производят исчерпывающую экстракцию из нативной грязи липидного комплекса с каротиноидами.

Полученный ацетоновый экстракт с липидным комплексом упаривают до объема 20-30 мл, количественно переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки ацетоном (первый экстракт). 5 мл полученного экстракта вносят в мерную колбу на 25 мл, доводят до метки ацетоном и колориметрируют на КФК-3 при длине волны 450 нм в кювете толщиной 10 мм. Содержание каротиноидов определяют по формуле:

где 0,738 - оптическая плотность испытуемого раствора;
2550 - удельный показатель поглощения, численно равный оптической плотности однопроцентного раствора бета-каротина при длине оптического пути = 1 см;
50,0 - объем растворителя, взятого для растворения липидного комплекса, мл;
5,0 - объем экстракта липидного комплекса, взятого для разведения;
25,0 - объем разведенного экстракта липидного комплекса в мл;
10,00 - навеска нативной грязи, г;
1000 - пересчет количества каротиноидов, мг%.

Аликвотную часть 1-го экстракта отбирают пипеткой на 25 мл и упаривают во взвешенной фарфоровой чашке емкостью 50 мл досуха, сушат при 60-90^oС до постоянного веса. Остаток сухого экстракта взвешивают, липидную фракцию отмывают 10-20 мл хлороформа до получения бесцветного раствора, который декантируют с осадка минеральных солей и серы. Оставшийся в чашке осадок сушат при 60^oС до постоянного веса. Содержание липидов определяют по формуле:

где 10,00 - навеска нативной грязи, г;
14,2620 - вес фарфоровой чашки с аликвотной частью ацетонового экстракта, г;
14,2373 - вес той же фарфоровой чашки с остатком минеральных солей и серы, полученных поле отмывки липидов хлороформом, г;
50,0 - объем экстракта липидного комплекса, мл;
25,0 - объем аликвотной части экстракта, взятый для определения содержания липидов, мл.

Содержание липидного комплекса в нативной грязи должно быть не менее 0,3%.

Содержание суммы каротиноидов (в пересчете на бета-каротин) должен быть не менее 1 мг%.

Таким образом, расчет количественного содержания каротиноидов значительно упрощается, повышается точность определения и достоверность результатов.

Изобретение относится к области медицины. Способ характеризуется тем, что проводится исчерпывающая экстракция липидного комплекса с каротиноидами в аппарате Сокслета ацетоном из сырой грязи, с последующим определением количества: 1) липидов - по разнице массы высушенного остатка аликвотной части ацетонового экстракта и массы содержащихся в ней минеральных солей и серы; 2) каротиноидов - по измерению оптической плотности при длине волны 450 нм в кюветах толщиной 10 мм и использованием для расчета удельного показателя поглощения, численно равного 2550 (величине оптической плотности однопроцентного раствора бета-каротина при длине оптического пути = 1). Способ прост и обеспечивает точность определения. 1 ил.

Способ определения липидов и каротиноидов в пелоидах путем их экстракции, отличающийся тем, что экстракцию проводят ацетоном и определяют количество липидов в экстракте по разнице массы высушенного остатка аликвотной части ацетонового экстракта и массы минеральных солей и серы той же аликвоты по формуле

где а - навеска нативной грязи, г;
b - вес аликвотной части ацетонового экстракта, г;
с - вес минеральных солей и серы, полученных из той же аликвотной части ацетонового экстракта, г;
V₁ - объем экстракта липидного комплекса, мл;
V₂ - объем аликвотной части экстракта, взятый для определения содержания липидов, мл,
при этом определение количества каротиноидов проводят в экстракте фотоколориметрически при длине волны 450 нм, по формуле

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
2550 - удельный показатель поглощения, численно равный оптической плотности однопроцентного раствора бета-каротина при длине оптического пути = 1 см;
V₁ - объем растворителя, взятого для растворения липидного комплекса, мл;
V₂ - объем экстракта липидного комплекса, взятого для разведения;
V₃ - объем разведенного экстракта липидного комплекса, мл;
а - навеска нативной грязи, г;
1000 - пересчет количества каротиноидов, мг%.