СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ КРОВИ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/92 

Способ относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использован в кардиологии и терапии.

Известны способы разделения на фракции липопротеинов крови методом аналитического ультрацентрифугирования (А. Н. Климов, Н.Г. Никульчева. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. - Питер, пресс, 1995, с. 98-102) и разделения на фракции ЛП в полиакриламидном геле (Н.Н. Шацкая. Биохимические исследования в оценке состояния сердечно-сосудистой системы. В кн. "Методы исследований в профпатологии", Москва, 1988, с. 95-97).

Описанные способы не позволяют выявить все фракции ЛП крови, включая ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а), а служат для разделения на фракции ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП от комплекса альбумина с неэстерифицированными жирными кислотами.

Описан также способ разделения на фракции ЛП путем электрофореза в геле агарозы (Лаб. Методы исследования/ Под редакцией В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987, с. 248-249).

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату (прототипом). Однако указанный способ недостаточно точен, так как не позволяет выявить модифицированные ЛП(а) кроме ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП. Это связано с исследованием малого образца сыворотки крови, не подготовленного для выявления мЛП. Концентрация ЛП(а) в крови очень низкая. В способе-прототипе лунка для внесения исследуемого образца сыворотки крови готовится в объеме металлического (стального) бруска с площадью основания 2•20 мм и высотой 10 мм, что не позволяет внести достаточно большой объем сыворотки крови или преципитатов сыворотки крови для исследования.

Целью предлагаемого изобретения является повышение точности способа.

Указанная цель достигается техническим решением, заключающимся в том, что дополнительно сыворотку крови обрабатывают 7% раствором ПЭГ - 6000, а затем инкубируют в 7% ПЭГ - 6000 преципитаты сыворотки крови с красителем Суданом Б при температуре 40^oС в темном термостате и вносят его для электрофоретического исследования в увеличенную в 2 раза по объему лунку геля агарозы.

Новым в данном способе является дополнительная инкубация 7% ПЭГ-6000 преципитата исследуемой сыворотки крови с красителем Суданом Б в течение часа в темном термостате при температуре 40^oС и заготовка лунки в геле агарозы для внесения исследуемого образца сыворотки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой в способе-прототипе. Лунка изготавливается с помощью стального бруска с площадью основания 4х20 мм, а не 2х20 мм как в способе-прототипе. Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат.

Для получения ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови использовался 7%-ный раствор ПЭГ-6000. Известно, что 7%-ный ПЭГ-6000 является предельной концентрацией для получения преципитататов сыворотки крови, содержащих иммунные комплексы и не содержащих грубодисперсных белков сыворотки крови. Применение 6%-ного раствора ПЭГ-6000 не позволяет полностью осадить иммунные комплексы сыворотки крови. Поэтому для повышения точности способа экспериментальным путем была выбрана 7%-ная концентрация ПЭГ-6000, позволяющая, с одной стороны, полностью осадить иммунные комплексы из сыворотки крови с гарантией отсутствия грубодисперсных (высокомолекулярных) белков сыворотки крови, а с другой стороны, позволяющая полностью осадить циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), присутствующие в сыворотке крови. Так, в случае концентрации ЦИК в сыворотке крови, равной 2,5 г/л, эта же концентрация ЦИК выявлена в 7%-ных преципитатах сыворотки крови (с результататом ± 3%), что связано с увеличением числа манипуляций, а не изменением концентрации ЦИК в преципитатах сыворотки крови.

Дополнительная инкубация 7% ПЭГ-6000 преципитата исследуемой сыворотки крови с красителем Суданом Б повышает сродство красителя к ЛП преципитатов крови, а увеличение объема взятого для исследований образца крови позволяет выявить модифицированные ЛП(а), содержащиеся в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в очень низких концентрациях, что позволяет повысить точность способа и получить желаемый результат. Предлагаемый способ позволяет выявлять следующие классы модифицированных ЛП: ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а).

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа.

Отличительные признаки проявили в заявленной совокупности новые свойства.

Идентичной совокупности признаков в известных решениях не обнаружено.

Данный способ возможно использовать в клинической практике.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "практическая применимость", "изобретательский уровень".

В настоящее время особое внимание уделяется исследованию модифицированных ЛП(а), в связи с чем разрабатываются способы лабораторной диагностики, позволяющие исследовать этот липопротеин крови. Он относится к апо-В-содержащим липопротеинам, богатым холестеролом (ХС). ЛП(а) идентичен "тонущим" пре-β-ЛП (sinking pre-β-Lp), имеющим при электрофорезе подвижность пре-β-ЛП. ЛП(а) содержат 27% белка, 8% углеводов и 65% липидов, из которых ЭХС составляют 59%, НЭХС 14%, ФЛ 14%.

Белковым компонентом ЛП(а) является высокогликозилированный полипептид - апо(а), имеющий близкое структурное сродство к плазминогену - одному из факторов системы свертывания - противосвертывания крови. При росте концентрации как ЛП(а), так и его модифицированных форм в крови нарушаются процессы микроциркуляции в кровеносных артериях с возможным образованием микротромбов.

Благодаря наличию в структуре апо(а) сиаловых кислот ЛП(а) более отрицательно заряжен по сравнению с β-ЛП в электрическом поле, лучше растворим в воде, может взаимодействовать с ионами металлов (кальция). Этот липопротеин и его модифицированные формы гетерогенны. Все это свидетельствует об особой роли ЛП(а) и модифицированных ЛП(а) в атерогенезе.

ЛП(а) может взаимодействовать с ЛПНП-рецепторами, оказывая слабое влияние на активность ГМК - Ко А редуктазы, на эстерификацию ХС. Период полураспада ЛП(а) длиннее, чем у ЛПНП и составляет 3,3 суток. Содержание ЛП(а) в крови в норме не превышает 30 мг/л. При высокой концентрации в крови ЛП(а) выявляется в местах поражения сосудов в области скопления фибриногена. Повышенная концентрация ЛП(а) часто сочетается с II^a, II^б типами гиперлипопротеидемий, при которых часто выявляются модифицированные ЛП. Поэтому в клинической практике крайне важно определение ЛП(а). Установлено, что большинство гиполипидемических препаратов не влияет на повышенный уровень ЛП(а). Мировые популяционные исследования показали, что ЛП(а) представляет собой самостоятельный и независимый фактор риска ИБС - наиболее тяжелого проявления атеросклероза. У здоровых лиц в 8% ПЭГ-6000 преципитатах крови ЛП отсутствуют. Модифицированные ЛПНП, ЛПОНП, ЛП(а) могут появляться в их составе при атеросклерозе.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способов лабораторной диагностики, позволяющих выявлять ЛП(а) и его модифицированные формы.

В настоящее время в широкой клинической лабораторной практике отсутствуют способы определения ЛП(а). В то же время популярность способа электрофоретического разделения на фракции ЛП крови в геле агарозы обусловлена его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов (Лаб. дело, 1980, 5, с. 287-290).

Метод основан на электрофоретической подвижности модифицированных липопротеинов крови.

Изобретение будет понятно из следующего описания приложенных чертежей.

Способ осуществляется следующим образом поэтапно:
1) приготовление раствора Судана Б: 400 мг Судана Б растворяют в 20 мг этиленгликоля на кипящей водяной бане в течение 50 минут, фильтруют, хранят в стеклянной посуде;
2) приготовление геля агарозы: 320 мг агарозы А фирмы "Sigma" растворяют в 20 мл воды при кипячении, затем помещают в термостат при 55^oС; добавляют 20 мл раствора альбумина (1 г альбумина в 200 мл веронал-мединалового буфера, рН 8,6). 3 мл геля агарозы наносят на обезжиренное горизонтально установленное предметное стекло, помещают металлический стальной стержень-брусок 20•4 мм (высотой 10 мм), который после застывания геля убирают магнитом;
3) к 1 мл сыворотки крови добавляют 40 мл 7% полиэтиленгликоля (ПЭГ)-6000 и инкубируют 1 час при 20^oС, центрифугируют 40 мин при 25000 g. Осадок дважды промывают.

4) 0,25 мл раствора преципитата используют для электрофоретического исследования. К 0,25 мл преципитата сыворотки крови добавляют 0,15 мл раствора Судана Б, помещают на 1 час в темный термостат при 40^oС, затем добавляют 0,2 мл горячего раствора геля агарозы, смешивают, подогревают при 55^oС и подогретым вносят в желобок геля агарозы;
5) предметное стекло помещают в камеру для электрофореза слоем агарозы вниз, электрофорез проводят в течение часа в холодильной камере при температуре 4^oС при напряжении 100 В и силе тока 40-45 мА;
6) электрофореграмму фиксируют в 5% растворе уксусной кислоты в течение одного часа, затем высушивают между листами фильтровальной бумаги, непрерывно смачивая 96% этиловым спиртом;
7) денситометрию проводят на микрофотометре МФ-4.

В группе контроля в 7% ПЭГ-6000 преципитатах сыворотки крови в случае использования способа-прототипа (n= 10) и предлагаемого способа (n=12) не выявлены ЛП (фиг.1 и 2).

Нами обследованы 2 группы больных ИБС по 10 (для способа-прототипа) - I группа и 32 пациента - II группа для проведения электрофореза ЛП 7% ПЭГ-6000 преципитатов сыворотки крови с помощью предлагаемого способа.

У пациентов I группы в 7% ПЭГ-6000 преципитатах выявлены ЛПНП и ЛПОНП (фиг. 3, 4 и 5). У 10 пациентов II группы в 7% ПЭГ-6000 преципитатах сыворотки крови кроме фракций ЛПНП, ЛНОНП в зоне между ЛПНП и ЛПОНП выявлена фракция модифицированных ЛП(а). У остальных пациентов этой группы фракция ЛП(а) не выявлена.

Клинический пример:
Пациент А, 48 лет. История болезни 481. Поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН с жалобами на боли за грудиной и в области сердца, возникающие при физической нагрузке, боли купируются нитроглицерином. Больного беспокоит одышка при физической нагрузке. АД 140/90 мм рт.ст., пульс в покое 66 удара в минуту.

Диагноз: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения ФК II.

Результаты лабораторных исследований:
ХС общий 8,4 ммоль/л;
триацилглицериды 1,6 ммоль/л;
ХС ЛПВП 0,92 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по способу-прототипу представлены на фиг. 7, а по предлагаемому способу на фиг. 8. Выявлены следы ХМ, ЛПНП, ЛПВП, ЛПОНП, ЛП(а).

В случае же использования дополнительно к способу-прототипу только добавочной инкубации исследуемого образца Суданом Б 1 час в темном термостате при температуре 40^oС и внесении его в лунку 2•20 мм, либо только увеличении объема лунки до 4•20 мм без дополнительной инкубации пробы фракции ЛПНП и ЛПОНП выявлялись несколько лучше, чем в контроле, а ЛП(а) определялась в виде следовой полосы, что не позволяло ее денситометрировать и, следовательно, оценивать количественно.

Использование предлагаемого способа позволило выявить у больных ИБС с выраженной гиперхолестеролемией наличие модифицированных ЛП(а) (мЛП(а)) способом электрофореза ЛП в геле агарозы.

Применение предлагаемого способа разделения на фракции ЛП крови в отличие от способа-прототипа позволило выявить дополнительную фракцию модифицированных ЛП(а), что повысило точность способа.

При этом предлагаемый способ прост в использовании и интерпретации полученных результатов.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии или терапии. Способ заключается в том, что обрабатывают сыворотку крови 7% раствором ПЭГ 6000, а затем инкубируют ПЭГ 6000-преципитат сыворотки крови с красителем суданом Б при 40^oС в темном термостате в течение часа и вносят его для электрофоретического исследования в увеличенную в 2 раза по объему лунку геля агарозы и при этом дополнительно определяют фракцию ЛП(а). Способ обеспечивает повышение точности. 8 ил.

Способ определения фракций модифицированных липопротеинов крови путем обработки сыворотки крови полиэтиленгликолем-6000 (ПЭГ-6000), инкубации с красителем суданом Б в течение 1 ч с последующим электрофоретическим разделением в геле агарозы, отличающийся тем, что используют 7% раствор ПЭГ - 6000, инкубацию проводят при 40^oС и при этом дополнительно определяют фракцию ЛП(а).