АЛЛЕРГЕН ДЛЯ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИХИНЕЛЛЕЗА У СВИНЕЙ Российский патент 2003 года по МПК A61B10/00 A61K39/35 

Предлагаемое изобретение относится к сельскому хозяйству, ветеринарии, конкретно к способам диагностики трихинеллеза свиней.

Методическими указаниями (1998) по лабораторной диагностике трихинеллеза и действующей инструкцией о мероприятиях по предупреждению и ликвидации заболевания животных гельминтозами (1999) предусмотрены посмертная и прижизненная диагностики трихинеллеза.

Посмертная: (микроскопический способ-КП) компрессориумная трихинеллоскопия (и биохимический) переваривание в искусственном желудочном соке (ИП). Прижизненная: - иммуноферментный анализ (ИФА); применялся длительное время кислотно-растворимый антиген БелНИИЭМ (инструкцией не предусмотрен). Они неравнозначны по эффективности. Так, в реферативном журнале "Ветеринария" РжВИНИТИ, 1985, 2,2.82.208. при сравнении специфичность КП не превышала 22%, а ИП=40%, ИФА (В.К. Бережко с соавторами, 1996) пишет о получении положительных результатов без указания процента специфичности, имеются данные до 40%. Следует отметить, что ИФА сложный, дорогой, требующий довольно длительного времени исследования и дающий неустойчивые результаты. Эффективность кислотно-растворимого аллергена БелНИИЭМ в сравнительном испытании с предлагаемыми нами тоже не превышала 40%.

В связи с резким обострением эпизоотической и эпидемиологической ситуации по трихинеллезу (групповые вспышки заболевания людей более 10 тыс. одновременно) для успешной локализации инвазии необходим доступный, эффективный аллергический метод диагностики трихинеллеза. А.С. Бессонов (1975) писал: "внутрикожная реакция является надежным методом выявления спонтанного трихинеллеза у свиней и может быть рекомендована для массовых эпизоотологических обследований в хозяйствах, неблагополучных или подозреваемых в неблагополучии по трихинеллезу". То есть, практике ветеринарии необходим простой, эффективный, моментальный по выполнению, дешевый способ прижизненной диагностики трихинеллеза, который можно применить непосредственно на ферме. По нашему мнению, это способ предлагаемого нами изобретения.

Поставленная цель достигается тем, что при создании аллергена использованы новейшие методики исследований, получен очищенный аллерген от балластных белков.

Пример осуществления способа.

Пассирование личинок трихинелл проводят на белых крысах. Через рот им с помощью шприца емкостью 2 мл дугообразно изогнутой медицинской трубчатой иглой с тупым концом вводят внутрь по 2 мл стандартной суспензии трихинелл (30-35 личинок на 1 г массы тела). Для стабилизации суспензии трихинелл используют 30%-ный раствор глицерина. Через 45-60 суток после заражения крыс убивают, снимают шкуры, удаляют внутренние органы, тушки обжигают горящим спиртовым факелом. Полученный костно-мышечный материал пропускают через стерильную мясорубку с диаметром решетки 1-1,5 мм. Фарш помещают в стерильные химические стаканы.

Переваривание костно-мышечного материала.

Искусственный желудочный сок подогревают до 37^oС. Отвешивают 18 г фарша, помещают его в предварительно подогретый до 37^oС химический стакан объемом 250 мл, заливают подогретым желудочным соком объемом 150 мл. Затем помещают в пластмассовый стакан микроизмельчителя тканей, между стаканами наливают подогретую до 47^oС воду. Систему стаканов помещают в микроизмельчитель тканей. Перемешивание массы проводят при скорости вращения ножей 5 тыс. об/мин, затем добавляют стерильный фосфатно-буферный раствор рН 7,3 до 500 мл и оставляют на 30 минут с целью осаждения трихинелл. Затем проводят отмывание трихинелл до полного просветления надосадочной жидкости, но не менее 10 раз. Промытый фосфатно-буферным раствором осадок, содержащий личинки трихинелл, центрифугируют на холодовой центрифуге при 0^oС 6000 об/мин в течение 40 минут.

Извлечение водорастворимых белков из живых или замороженных личинок трихинелл проводится механической гомогенизацией в стеклянном микрогомогенизаторе типа Поттера-Эльвагейма с тефлоновым пестиком в течение 10 минут при 0^oС и 2000 об/мин. В дальнейшем фрагменты разрушаются ультразвуком с амплитудой колебания волновода 30+10 мкм в три приема по 30 сек с интервалом в 1 минуту. Затем гомогенат в соотношении 1:5 осадка к раствору в 0,25%-ном растворе трипсина при 37^oС выдерживают в термостате в течение 2-х часов. Отмывают фосфатно-солевым раствором рН 7,3 и центрифугируют при 0^oС 6000 об/мин в течение 40 минут. Затем массу помещают в искусственный желудочный сок в соотношении 1:2 для переваривания в термостате при температуре 37^oС на 18 часов.

Осадок отмывают стерильным фосфатносолевым буфером трижды, центрифугируя его при 6000 об/мин, при температуре 0^oС в течение 40 минут. Объем осадка определяют в мерном цилиндре, разводят его стерильным фосфатно-солевым буфером рН 7,3 в 200 раз. Полученную эмульсию разводят по объему двойным количеством стерильного 8%-ного раствора сахарозы, разливают по стерильным флакончикам по 10-20 мл. В каждый флакончик добавляют по 1 мл среды высушивания, замораживают в жидком азоте.

Подготовленные таким образом флаконы с препаратом в замороженном состоянии помещают в камеру для лиофильной сушки. Лиофилизацию проводят в вакууме по соответствующей схеме, флаконы с высушенным препаратом закрывают резиновыми пробками, покрывают алюминиевыми колпачками и закрывают на закаточной машине.

Готовый препарат представляет собой сухую аморфную массу белого цвета, состоящую из полисахаридных комплексов, выделенных из мышечных личинок трихинелл. Консистенция его - аморфная, сухая.

При внутрикожном введении инжекторным способом в разведении 1:10 при помощи безигольного инъектора аллерген у зараженных трихинеллами животных вызывает положительную кожную реакцию.

Стерильность препарата определяется согласно "Методическим указаниям по бактериологическому контролю стерильности биологических препаратов". Пробы из каждой серии высевают на МПБ, МПА (аэробы), тиогликолиевую среду (аэробы). Посевы культивируются в термостате при 37^oС в течение 5-7 суток и в течение этого срока должны быть стерильными.

На безвредность аллерген проверяется на белых мышах (3-5), вводится им через иглу внутрибрюшинно в дозе 1 мл на голову. В процессе наблюдения все мыши должны остаться живыми.

Специфичность проверяется на зараженных трихинеллами свиньях внутрикожным инжекторным введением аллергена в дозе 0,2 мл в верхнюю поверхность ушной раковины. Реакцию учитывают через 30, 60, 90 и 120 минут после введения. Местная реакция проявляется первые 15-20 минут (реакция немедленного типа) и сохраняется до 120 минут. Положительной реакция считается при значительном покраснении участка кожи на месте введения и папула размером 10•10 мм и больше.

В условиях производства в трех хозяйствах Ростовской области и Краснодарского края нами комиссионно на 325 свиньях разных возрастов неблагополучных по трихинеллезу хозяйств, подозреваемых в заражении трихинеллами, проведено испытание непосредственно в условиях ферм. Место инъекции дезинфицировали по общепринятым правилам. Перед применением препарата проверяли этикетку, где указано название аллергена, номер серии, количество доз, срок годности. Препарат разводили перед применением раствором хлорида натрия 0,9%-ного в соотношении 1:10. Во всех случаях аллерген показал специфичность в различных хозяйствах и на разных возрастных группах от 33,3 до 66,6, 100%. В том числе обследовали 10 свиноматок в Краснодарском крае, которые ранее были обследованы по методу ИФА и шесть из них показали сомнительный результат. Нами у всех 10 свиноматок аллерген дал отрицательный результат, достоверность которого подтверждена методом переваривания в искусственном желудочном соке.

При получении сомнительных результатов кожную пробу следует повторить через 2-3 дня (после стихания местной реакции на предыдущее тестирование). Неиспользованный в течение дня разведенный препарат подлежит утилизации (см. таблицу - схема учета реализации).

Технико-экономическая эффективность предлагаемого технического решения задачи по сравнению с прототипом.

Достигается 33,3-100%-ная диагностическая эффективность аллергена на зараженных трихинеллами животных. В отличие от прототипа - кислоторастворимого аллергена БелНИИЭВ, показавшего при сравнительном испытании эффективность, не превышающую 40%.

Предлагаемый нами аллерген может быть рекомендован для массовых эпизоотологических обследований в хозяйствах, неблагополучных по трихинеллезу.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, ветеринарии, конкретно к способам диагностики трихинеллеза свиней. Аллерген представляет собой полисахаридные комплексы мышечных личинок трихинелл, выделенные путем механической гомогенизации и воздействия ультразвука. Аллерген может быть использован для массовых эпизоотологических обследований в хозяйствах, неблагополучных по трихинеллезу. Аллерген можно использовать в условиях фермы, результат получить в течение нескольких часов, при этом специфичность диагностики превышает показатели аналога более чем в 2 раза. 1 табл.

Аллерген для прижизненной диагностики трихинеллеза у свиней, представляющий собой полисахаридные комплексы мышечных личинок трихинелл, выделенные путем механической гомогенизации и воздействия ультразвука.