СОСТАВ КОМПОНЕНТОВ ПЕРЕВАРИВАЮЩЕЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ ЭКСПЕРТИЗЫ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ НА ТРИХИНЕЛЛЕЗ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/12 C12Q1/25 

Изобретение относится к ветеринарной санитарии и гельминтологии, в частности к экспертизе мясных продуктов на трихинеллез.

Актуальность проблемы. Обеспечение продовольственной безопасности Российской Федерации и выпуск мясной продукции, благополучной по санитарным показателям, является приоритетной задачей агропромышленного комплекса, ветеринарной медицины и здравоохранения.

Важное значение в этой области отводится совершенствованию научно-методической базы и приборного обеспечения ветеринарно-санитарной экспертизы. Решение этих задач приобретает особую актуальность в условиях производства мяса и мясопродуктов в хозяйствах частного сектора, мелких кооперативных, фермерских хозяйствах, не всегда отвечающих необходимым зооветеринарным требованиям.

Определенную опасность представляет также и мясное сырье, поступающее в Российскую Федерацию в рамках импортных поставок, не прошедшее в полном объеме ветеринарно-санитарного контроля.

В связи с этим ветеринарная служба осуществляет мониторинг и контроль за выпуском качественной в паразитологическом отношении продукции животноводства, обеспечивает защиту населения от паразитарных зоонозов.

Гельминтозоонозы, и в частности трихинеллез, необходимо также рассматривать как патоген, представляющий угрозу как биологический объект, который может быть использован в определенных случаях для массового поражения населения. В этом плане обеспечение биобезопасности в отношении этого возбудителя имеет важное социальное значение.

Одним из ведущих методов профилактики заражения населения трихинеллезом является трихинеллоскопический контроль, осуществляемый с помощью переваривания мышечной ткани в искусственном желудочном соке (ИЖС) и компрессорного исследования (Рекомендации МКТ, 2001).

Метод переваривания мышечной ткани в ИЖС, применяемый при диагностике трихинеллеза, является более достоверным и чувствительном, чем компрессорная микроскопия. Применяемый для переваривания мышечной ткани стандартный состав ИЖС включает воду, соляную кислоту и пепсин в соответствующих концентрациях, определяемых типом используемого пепсина (медицинский, свиной и т.д.).

В настоящее время разработаны аппараты типа АВТ, которые широко используются на мясокомбинатах и рынках (Успенский А.В. с соавт., 2000, 2005). Время переваривания мышечной массы (пептолиза) в аппаратах сокращено до 35 минут, что вписывается в ритм убойного конвейера.

Одним из технологически сложных этапов подготовки рабочих растворов для пептолиза является применение соляной кислоты, поскольку имеется специфика работы с этим опасным компонентом. Использование концентрированной соляной кислоты в производственных условиях мясокомбинатов небезопасно и трудоемко. Кроме того, срок хранения приготовленных растворов не превышает суток. Сложность заключается и в особенностях хранения, разведения и, соответственно, использования при приготовлении искусственного желудочного сока.

Учитывая это, представлялось целесообразным разработать состав ИЖС, где соляная кислота, находясь в связанном состоянии, не представляла бы опасности для лабораторных работников. Обеспечение агрегирования этого компонента с пепсином позволило бы создать новую форму (сыпучую или в виде таблеток), позволяющую полностью исключить прямой контакт с соляной кислотой, стандартизировать компоненты ИЖС и значительно облегчить условия работы при проведении трихинеллоскопического контроля методом пептолиза. Возможно и создание таблетизированной формы с включением компонентов, обеспечивающих сохранение структуры личинок при длительном воздействии на них ИЖС.

Цель изобретения - найти состав легко транспортируемых в сухом виде компонентов для оптимального способа переваривания мышечной ткани животных (пептолиза), применяемый в лабораторных, производственных и полевых условиях для диагностики трихинеллеза.

Характеристика аналогов изобретения. Стандартный (классический) метод переваривания мясного фарша заключается в использовании раствора ИЖС, для приготовления которого берут 10 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л воды и медицинского или свиного пепсина от 3 до 7% (Владимирова П.А., 1972, Скворцова Ф.К., 2006, Гребенкина Л.А., 2008). Переваривание проводят в температурном оптимуме действия фермента при 37-42°С в лабораторных условиях (пассивный метод) 14-16 часов или на аппаратах типа АВТ (Скворцова Ф.К., Успенский А.В., 2006.)

Прототипом может служить медицинский препарат - Ацидин-пепсин, выпускаемый в виде таблеток. Ацидин-пепсин - препарат, содержащий в качестве действующих веществ фермент пепсин и солянокислую соль бетаина (синонимы - ацидин, триметиламин). Препарат применяется в медицине для лечения больных гастритом с пониженной кислотностью желудочного сока для улучшения переваривания пищи (Машковский М.Д., 2008).

Недостатком прототипа является то, что смесь бетаина солянокислого с пепсином в любых соотношениях без дополнительных компонентов не обладает способностью переваривания мясного фарша и не может быть использована для диагностики трихинеллеза.

Наша работа отличается тем, что в состав предлагаемого переваривающего раствора дополнительно включена лимонная кислота.

Сущность изобретения состоит в использовании состава из трех сухих компонентов (пепсина, триметиламина солянокислого и лимонной кислоты) для искусственного желудочного сока, которые растворяют в воде в определенных соотношениях непосредственно перед применением или могут использовать раствор из них в течение нескольких дней.

Ценность изобретения. Сухие компоненты для переваривающей жидкости легко и безопасно транспортируются и могут использоваться при диагностике трихинеллеза в производственных условиях лабораторий мясокомбинатов и полевых условиях в охотничьих хозяйствах, в сельских ветеринарных пунктах, бойнях.

Данный состав искусственного желудочного сока обладает высокой переваривающей способностью и полностью исключает применение концентрированной соляной кислоты в процессе приготовления ИЖС.

Разработка нового состава искусственного желудочного сока

Формула изобретения состоит в том, что с целью замены применяемой в анализе концентрированной соляной кислоты предложено использовать смесь сухих компонентов, состоящую из триметиламина солянокислого (бетаина) и лимонной кислоты в эквивалентных соотношениях, которая при комнатной температуре находится в твердом состоянии и удобно транпортируется.

Использование подобной смеси компонентов можно объяснить происходящей в водных растворах реакцией обмена между триметиламином солянокислым и лимонной кислотой. Реакция обратима, однако постоянное использование соляной кислоты ферментом пепсином сдвигает направление реакции в сторону образования свободной соляной кислоты. Для решения данной задачи использовали препарат бетаин-триметиламин N(СН₃)₃·HCl, включающий:

N(СН₃)₃·HCl м.м.=94,57

В расчете на 1 литр рабочей среды 1 м р-р 94,57 г в литре (0,1 м р-р - 9,46 в 1 л) (0,1 м=0,1 н).

В целом на 1 литр среды используется 10,0-12,0 г бетаина (общий 1,0-1,2% раствор).

Важным и необходимым компонентом этого комплекса является лимонная кислота, позволяющая вытеснить HCl в раствор из солянокислого бетаина.

(0,1 м раствор - 21 г в 1 л, 0,1 н раствор - 7 г в 1 л).

Таким образом, ионообменная реакция осуществляется по следующей схеме:

3[N(СН₃)₃·HCl]+H₃C₆H₅O₇·H₂O↔3[N(СН₃)₃]H₃C₆H₅O₇·H₂O+3HCl

В последующем выделенная в раствор соляная кислота в комплексе с пепсином соответствующей концентрации собственно и составляет искусственный желудочный сок.

Технологическая схема приготовления искусственного желудочного сока

1. Приготовить навески препаратов из расчета на 1 л воды: 10 г бетаина, 14 г лимонной кислоты и пепсина 3-20 г в зависимости от его активности.

2. В 1 л воды при температуре 39-40°С растворить бетаин и лимонную кислоту. После растворения добавить пепсин.

3. Внести навеску мясного фарша в ИЖС и проводить переваривание пассивным или аппаратным методом при 39-42°С.

4. Водный раствор бетаина и лимонной кислоты при комнатной температуре 22°С сохраняет свои свойства в течение 72 часов.

Примеры конкретного выполнения

1. Активность сухого состава ИЖС при пассивном (лабораторном) методе пептолиза мышечной ткани для диагностики трихинеллеза

При проведении переваривания воздействию фермента подвергается в первую очередь мышечная ткань. Затем в процессе пептолиза происходит переваривание капсул с паразитом и, соответственно, высвобождение личинок трихинелл. На этом собственно и основывается послеубойная диагностика трихинеллеза.

При сравнительном изучении результатов пептолиза 35 г мышечной ткани с трихинеллами стандартным методом (с использованием 0,3% пепсина свиного и 1% соляной кислоты в расчете на 1000 мл среды) и бетасола, включающего 0,3% пепсина свиного, 0,5% бетаина и 1,2% лимонной кислоты, получили аналогичные результаты.

За 6, 12 и 24 часа в каждом опыте соответственно переваривалось примерно 25, 40 и 90% мышечной ткани, при этом в осадке регистрировали в разных случаях от 1 до 5% непереваренных капсул. Количество личинок трихинелл, выделенных в результате пептолиза с использованием стандартного ИЖС и сухого состава ИЖС, также было одинаково. В процессе всей продолжительности пептолиза (24 часа) личинки сохраняли двигательную активность, случаев их деструкции не отмечали.

В соответствии с полученными результатами провели повторные опыты с использованием проб охлажденного и мороженого свиного мяса со срезами, включающими личинки трихинелл, и мышечной ткани крыс, зараженной трихинеллами. Во всех случаях динамика переваривания проб и выделения личинок трихинелл с использованием сухого состава ИЖС соответствовала исследованию проб со стандартным ИЖС.

2. Активность сухого состава ИЖС в режиме автоматизированной диагностики трихинеллеза

С целью оптимизации ветеринарно-санитарной экспертизы на трихинеллез на основе применения сухого состава ИЖС выполнили комплекс исследований по отработке режимов пептолиза с помощью автоматизированных устройств типа АВТ.

Основными требованиями в отношении исследования образцов мышечной ткани на трихинеллез являются, особенно в условиях производства, продолжительность и качество переваривания. Эта цель достигается рядом технологических условий. Ускорение процесса переваривания на АВТ-Л6 неизбежно связано с увеличением концентрации пепсина и соляной кислоты, что может приводить к частичной гибели личинок.

Наиболее важное значение имеет концентрация пепсина и оптимальное соотношение пепсин + соляная кислота или пепсин + бетаин + лимонная кислота и скорость активации среды. При недостаточно высокой активности пепсина возможно повышение его количества в расчете на общий объем искусственного желудочного сока и массы исследуемого материала.

Для отработки технологии переваривания образцов с использованием автоматизированной системы трихинеллоскопического контроля провели 6 циклов исследований с применением полной загрузки прибора, включающего два реактора. Одновременно в разных реакторах тестировали стандартный ИЖС и сухой состав ИЖС.

С целью подтверждения динамики пептолиза, выявленной без активации среды (перемешивания), в автоматизированной системе использовали соотношение оптимальных компонентов, давших ранее положительные результаты с учетом активности пепсина. В каждом опыте на 1 л воды взяли 20 г пепсина и 30 г охлажденной свиной мышечной массы с добавлением 5 г зараженного трихинеллами фарша крыс. Для приготовления стандартного ИЖС добавляли 10 мл соляной кислоты, для опыта ИЖС включал 10 г бетаина и 14 г лимонной кислоты. Результаты опытов представлены в таблице 1.

При повышении концентрации пепсина в ИЖС до 2% эффективность пептолиза значительно ускорялась в каждом случае. Уже в течение одного цикла (30 минут) в бетасоле переварилось 47,8% первоначальной массы.

Спустя еще 30 минут (цикл 2) пептолизу подвергалось 72,8%, а в период третьего-пятого циклов до 93,4%. Практически полное переваривание образцов в бетасоле отмечали к концу заключительного шестого цикла.

Оценивая эффективность нового состава ИЖС бетасол в аспекте экспертизы на трихинеллез, необходимо отметить динамику выделения личинок трихинелл (таблица 2).

Таблица 2 Динамика выделения личинок трихинелл при использовании стандартного ИЖС и сухой состав ИЖС в режиме активации среды № п/п Стандартный ИЖС Сухой состав ИЖС Выделено личинок (%) Целых капсул (%) Выделено личинок (%) Целых капсул (%) 1 цикл 47 5 45 5 2 цикл 32 2 35 2 3 цикл 10 2 12 2 4 цикл 3 2 3 2 5 цикл 3 2 3 2 6 цикл 2 1 2 1

Основная масса личинок трихинелл (45%) в опыте выделялась в течение первого же цикла, второго цикла - 35%. В последующем количество личинок в осадке резко уменьшалось и в период между третьим и 6 циклом регистрировали от 12 до 2% личинок. В контроле с использованием стандартного ИЖС в процессе пептолиза прослеживалась аналогичная динамика выделения личинок трихинелл.

Отмеченная динамика выделения личинок позволяет утверждать, что данная концентрация пепсина в комплексе с бетаином и лимонной кислотой способствует их быстрому выделению из мышечной ткани, что очень важно для экспресс-диагностики трихинеллеза.

Уже в течение первого цикла (30 минут) при отборе пробы выявление личинок в осадке позволяет практически приостановить дальнейшее исследование единичных или групповых образцов и выдать заключение о санитарном качестве исследуемой мясной продукции на трихинеллез.

При проведении переваривания с помощью сухого состава ИЖС воздействию фермента подвергается в первую очередь мышечная ткань. Затем в процессе пептолиза происходит переваривание капсул с паразитом и, соответственно, высвобождение личинок трихинелл. На этом собственно и основывается послеубойная диагностика трихинеллеза.

Таким образом, в технологии ветеринарно-санитарной экспертизы на трихинеллез с использованием сухого состава ИЖС целесообразно предусмотреть контрольный отбор проб в период 15-20 минут после начала пептолиза. Это позволит значительно повысить экономическую эффективность исследования, сократить общее время на проведение трихинеллоскопического контроля и облегчить в целом работу трихинеллоскопистов.

В целом сравнительные испытания стандартного состава ИЖС и сухого состава ИЖС с использованием проб инвазированной трихинеллами мышечной ткани указывают на идентичные результаты как по технологическим параметрам, так и диагностической эффективности.

Источники информации

1. Владимирова П.А. Перспективы использования в практике метода переваривания проб мышц в искусственном желудочном соке для диагностики трихинеллеза. // Мат. докл. Всес. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных. - Вильнюс. - 1972, - с.124.

2. Гребенкина Л.А. Усовершенствование метода пептолиза с целью повышения эффективности трихинеллоскопического контроля // Российский паразитологический журнал. - 2008. - №4. - с.57-59.

3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. // М. - Издание пятое. - 2008. - с.657.

4. Рекомендации Международной комиссии по трихинеллезу (МКТ) по методам борьбы с трихинеллезом домашних и диких животных, мясо которых употребляется в пищу человеком. // Ветеринария. - 2001. - №8. - с 57-63.

5. Скворцова Ф.К., Успенский А.В. Диагностическая эффективность АВТ-Л6 для выявления бескапсульных личинок трихинелл. // Мат. докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М. - 2006. - С.375-378.

6. Скворцова Ф.К. Метод получение инвазионного материала для наработки антигена трихинелл. // Тр. Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И.Скрябина. - М. - 2006. - Т.42. - С.599-608.

7. Успенский А.В., Бессонов А.С., Шеховцев Н.В. Автоматизация трихинеллоскопического контроля. // Восьмая Всероссийская конф. по трихинеллезу. - М. - 2000. - c.153-156.

8. Успенский А.В., Бессонов А.С., Шеховцев Н.В., Гребенкин С.А. Методические рекомендации по применению аппаратов для выделения личинок при ветеринарно-санитарной экспертизе туш и мясопродуктов. // Тр. Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И.Скрябина. М. - 2005. - т.41. - с.447-452.

Изобретение относится к ветеринарной санитарии и гельминтологии, в частности к экспертизе мясных продуктов на трихинеллез. Состав компонентов переваривающей жидкости для экспертизы мясных продуктов на трихинеллез, в котором используют смесь сухих компонентов на 1 л воды в следующих соотношениях сухого состава искусственного желудочного сока, г:

триметиламин солянокислый (бетаин) 10 лимонная кислота 14 пепсин 3-20

Изобретение обеспечивает повышение безопасности и удобства транспортировки. 2 табл.

Состав компонентов переваривающей жидкости для экспертизы мясных продуктов на трихинеллез, отличающийся тем, что, с целью безопасности и удобства транспортировки, вместо жидкой соляной кислоты используют смесь сухих компонентов на 1 л воды в следующих соотношениях сухого состава искусственного желудочного сока, г:
триметиламин солянокислый (бетаин) 10 лимонная кислота 14 пепсин 3-20