СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ Российский патент 2003 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к области аналитической химии и фармакологии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения флавоноидов кверцетина, менадиона, байкалина, диквертина, структурные формулы которых приведены в таблице 1. Флавоноиды в большем или меньшем количестве содержатся почти во всех высших растениях, реже встречаются у микроорганизмов и насекомых.

Флавоноиды имеют широкий спектр действия на организм: высокая Р-витаминная активность, нормализуют проницаемость капилляров, укрепляют и делают более эластичной сосудистую стенку. Обладают диуретическим, гипоазотемическим, гипотензивным, гипогликемическим, эстрогенным, спазмолитическим, желчегонным действием [Блинова К.Ф., Яковлева Г.П., Ботанико-фармакологический словарь. - М.: Высшая школа, 1990]. Некоторые из них являются эффективными антиоксидантами, например кверцетин [Запрометов М.Н., Основы биохимии фенольных соединений. - М.: Высшая школа, 1974]. Исследования последних лет показали, что лекарственные препараты растительного происхождения, содержащие соединения полифенольной структуры, уменьшают ксенобиотическую нагрузку на организм и обладают высокой цитопротекторной активностью, в частности при патологиях, сопровождающихся нарушением функции митохондрий, развитием перекисного окисления липидов.

Согласно временной фармакопейной статье 42-1399-80, качество жидких экстрактов флавоноидсодержащих растений оценивают по содержанию в нем сухих веществ [Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока, т. - 2. Тезисы всесоюзной конференции, Томск, 1989]. Очевидно, что только по этому показателю нельзя объективно судить о терапевтической ценности препарата. В связи с этим определение микроколичеств флавоноидов очень важно для оценки качества сырья и биологически активных добавок, идентификации действующих веществ в лекарственных формах. Поэтому аналитическая практика предъявляет повышенные требования к совершенствованию методов определения флавоноидов.

Старейшими методами обнаружения флавоноидов являются титрометрические методы в среде неводных растворителей: ацетона, диметилформамида, диметилсульфоксида, с использованием в качестве титрантов гидроксиды тетраэтиламмония или натрия. Для проведения количественной оценки этими методами необходимо предварительное разделение компонентов, что увеличивает длительность методик. Чувствительность определения невелика и составляет 10^-2-10^-3 моль/л [Георгиевский В. П., Физико-химические методы анализа биологически активных веществ растительного происхождения. - Ашхабад, "Ылым", 1976].

Известны оптические методы определения флавоноидов, основанные на измерении длины волны в максимумах поглощения, анализируемых веществ и их окрашенных комплексов. Широкое применение получил прямой и дифференциальный спектрофотометрические методы. Рабочими диапазонами длин волн служат максимумы (330-370 нм) [Смирнова Л.П., Первых Л.Н., Количественное определение суммы флавоноидов в желчегонном сборе. //Химико-фармацевтический журнал 3 - 1999, с. 37-39. Сироткина Е.Е., Выделение и анализ биологически активных веществ, Томск, 1987]. Наиболее чувствительным является боргидридный метод. Метод не нашел широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспроизводимости результатов, однако позволяет определять суммарное содержание флавоноидов в растворе, но не позволяет идентифицировать отдельные компоненты в смеси. Таким образом, применение оптических методов ограничено их неселективностью внутри класса соединений, и низкой чувствительностью 5•10^-4-1•10^-2 мг/мл [Георгиевский В.П., 1976, Лакович Дж. , Основы флуорисцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986, с. 496]. Поэтому такие методы не могут быть использованы для определения исследуемых веществ в многокомпонентных смесях.

Широкое распространение получили при определении флавоноидов различные варианты хроматографии. Методы тонкослойной хроматографии связаны со значительными трудностями при количественной оценке хроматограмм. В последнее время наибольшее применение получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для увеличения чувствительности определения физико-химических методов используют ультрафиолетовое, флуориметрическое и электрохимическое детектирование. Несмотря на высокую чувствительность ВЭЖХ (10^-5-10^-5 мг/мл), длительность анализа, а также высокая стоимость приборов существенно ограничивают его использование в биохимических исследованиях [Георгиевский В. П.- 1976, Никитина Т.И., и др. Разработка методов стандартизации многокомпонентных сборов// Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений. Томск, 1996, с. 117-119., Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.: Мир, 1988, с. 645 - 650].

Электрохимическому исследованию флавоноидов посвящены единичные работы. Для определения флавоноидов использовали полярографические методы с ртутным капельным индикаторным электродом. В работе [Георгиевский В.П.,1976] показана способность менадиона и кверцетина восстанавливаться на ртутном капельном электроде. Сделана попытка их количественного определения в растительном сырье. Однако величины потенциалов полуволн (E_1/2) различных флавоноидов мало отличались, поэтому полярографическим методом определяли их общее содержание. При этом требовалась тщательная очистка флавоноидов, так как определению мешали сопутствующие вещества. Наиболее близким является метод определения менадиона (прототип) [Мискиджьян С.П., Кравченюк Л.П. Полярография лекарственных препаратов, Киев: Вища школа, 1976, с. 229]. Сущность методики состоит в том, что растворенный менадион предварительно гидролизуют и полученный 2-метил 1,4 нафтохинон окисляют сульфатом Се (IV) или бромом в 20%-ном спиртовом растворе буфера Бриттона - Робинсона (рН 7). Полярографическую волну определяемого вещества регистрируют при потенциале E_1/2=-0,28 В. В качестве фона использовали 0,3 моль/л раствор LiCl в безводном метаноле. Классическая постояннотоковая полярография обеспечивает определение менадиона более 5•10^-4 моль/л при относительной области определяемых содержаний от 5•10^-4 до 5•10^-3 моль/л [Мискиджьян С.П., Кравченюк Л.П., 1976]. Этот метод позволяет определять флавоноиды в фармакологических препаратах, но не позволяет определять их в растительных экстрактах. Одним из ограничивающих факторов применения полярографии в биохимических лабораториях является использование больших количеств металлической ртути в качестве электродов в электролитической ячейке.

Условия полярографического определения диквертина и байкалина в литературе практически отсутствуют.

Электороаналитические методы и в первую очередь такие его высокочувствительные варианты, как дифференциальная вольтамперометрия (ДВА), пережили в последние годы своеобразное "возрождение", и не только по причине невысоких затрат на их реализацию, но главным образом потому, что они отвечают современным требованиям к контролю качества разнообразных и сложных по составу систем. При соблюдении требований ультрамикроанализа вполне реально определение 10^-8-10^-9 мг/мл. Однако большинство опубликованных работ по анализу электрохимическими методами посвящено определению металлов. Идентификация природных органических веществ, флавоноидов и их метаболитов в лекарственных препаратах, в растительных экстрактах и в пищевых биологически активных добавках становится с каждым годом все более актуальной проблемой.

Информация о применении метода вольтамперометрии (ВА) для определения флавоноидов в литературе не описана. Поэтому разработка экспрессных и высокочувствительных методов определения флавоноидов продолжает представлять интерес.

Задачей заявляемого изобретения является повышение чувствительности, экспрессности и селективности определения флавоноидов методом дифференциальной вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что флавоноиды переводят в раствор путем растворения навески пробы в 70%-ном этиловом спирте при нагревании с последующей регистрацией катодных или анодных пиков. Новым в способе является то, что вольтамперометрическое определение ведут на стеклоуглеродном электроде по пикам восстановления при потенциалах от +0,41 до -0,63 В (относительно насыщенного хлоридсеребрянного электрода, нас. х.с.) или по пикам окисления при потециалах от -0,36 до +0,46 В, на фонах 0,2 н. Na₂HPO₄ или 0,2 н. аммония лимоннокислого двузамещенного (С₆Н₁₄O₇N₂), регистрацию пиков проводят при линейной скорости развертки потенциала 20-30 мВ/с в дифференциальном режиме съемки вольтамперограммы и концентрации флавоноидов: кверцетина, диквертина, менадиона, байкалина, определяли по высоте пиков восстановления при потенциалах +0,37 В; (+0,14±0,02) В; (-0,22±0,02) В; -(0,60±0,03) В соответственно на фоне 0,2 н. Na₂HPO₄ или по высоте пиков восстановления при потенциалах (+0,33±0,01) В; (-0,40±0,02) В; (-0,15±0,02) В; -0,60 В; соответственно на фоне 0,2 н. C₆H₁₄O₇N₂ или по высоте пиков окисления при потенциалах (+0,39±0,02) В; (+0,40±0,02) В; -0,34 В; (+0,20±0,02)В соответственно на фоне 0,2 н Na₂HPO₄ или по высоте пиков окисления при потенциалах (+0,36±0,02) В; +0,45 В; (-0,15±0,01) В; (+0,35±0,01) В соответственно на фоне 0,2 н. С₆Н₁₄O₇N₂.

В прототипе описано использование в качестве фона 0,3 моль/л раствор LiCl в безводном метаноле. Определение менадиона в этих условиях затруднено из-за низкой чувствительности определения, связанной, по-видимому, с плохой растворимостью флавоноидов в метаноле. Использование высокотоксичного метанола ограничивает применение методики в серийных анализах. Предлагаемые в заявленном изобретении фоны 0,2 н. Na₂HPО₄, pH 8,6 и 0,2 н. C₆H₁₄О₇N₂, pH 7 позволяют определять флавоноиды на уровне нанограммовых содержаний с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение (Sr) для концентрации флавоноидов 1•10^-8 мг/мл не превышает 0,2. Все фоны подобраны экспериментально. Фон 0,2 н. Na₂HPО₄ использовался в вольтамперометрических исследованиях, однако абсолютной новизной является использование подобранных значений pH раствора Na₂HPO₄ и использование в качестве фона 0,2 н. аммония лимоннокислого двузамещенного, от чего зависит количественное определение флавоноидов. Кроме того, использование цитратного фона приводит к лучшей воспроизводимости результатов при анализе биологических и природных объектов, так как раствор аммония лимоннокислого двузамещенного является хорошим осадителем растворимых белковых примесей в таких пробах. Оптимальный диапазон pH фоновых растворов электролитов 7-9 определяется хорошей воспроизводимостью и фиксированием практически одного пика при регистрации вольтамперограмм. Более низкие значения pH (pH<7) и более высокие (pH>9) нежелательны, так как изменяется форма нахождения флавоноида в растворе, что связано со смещением протеолитического равновесия органического вещества в растворе. Это приводит к регистрации дополнительных предпиков, увеличению остаточного тока и снижает чувствительность, экспрессность и селективность определения. На фонах 0,2 н. Na₂HPO₄ и 0,2 н/ C₆H₁₄O₇N₂ впервые получены пики окисления и восстановления на стеклоуглеродном электроде (в прототипе исследовались только пики восстановления с использованием ртутного капельного электрода). Что позволило проводить определение флавоноидов на уровне 10^-8-10^-6 мг/мл методом ДВА.

Другим отличительным признаком является использование в качестве индикаторного электрода стеклоуглеродных электродов. Впервые установлена возможность электроокисления и электровосстановления флавоноидов с использованием угольных электродов. В качестве индикаторных применяли три типа углеродных электродов - графитовый, пропитанный полиэтиленом с парафином в вакууме или эпоксидной смолой, пирографитовый (ПГ) и стеклоуглеродный (СУ). Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов как в водной, так и в неводных средах, а также простотой механического обновления поверхности [Брайнина Х.З., Нейман Е.Я., Слепушкин В.В., Инверсионные электроаналитические методы. - М.: Химия, 1998, c. 239]. Такие электроды являются нетоксичными.

Величина потенциалов окисления и восстановления флавоноидов определяется строением, структурой и степенью адсорбируемости на гексагонах графита, имеющих π-зонную структуру. Структурное подобие материла электрода и адсорбция плоскостью молекулы (стереоспецифическая адсорбция), по- видимому, благоприятствует переходу электронов при меньшем значении потенциала и способствует обратимому окислению и восстановлению флавоноидов на графите, чем на СУ и ПГ. Однако из-за большого остаточного тока графитовый электрод оказался менее удобным в работе, чем СУ, особенно при количественном определении флавоноидов в растительных экстрактах.

Из табл. 2 видно, что легче всего восстанавливается кверцетин, а окисляется менадион.

Важным для определения флавоноидов методом ДВА является выбор скорости развертки потенциала. Оптимальной является скорость 20-30 мВ/с. Увеличение скорости более 20 мВ/с увеличивает чувствительность, но при этом растет остаточный ток и уменьшается разрешающая способность способа. При скорости менее 20 мВ/с снижается величина анодного и катодного токов и понижается чувствительность определения флавоноидов. Значение используемой скорости в прототипе не приведено.

Таким образом, подобранные условия впервые позволили количественно определять флавоноиды на уровне 3,5•10^-8 мг/мл без предварительного выделения их из проб. Диапазон определяемых содержаний 3,5•10^-8-1•10^-6 мг/мл. Определению не мешают тысячекратные избытки лимонной, щавелевой, аскорбиновой кислот.

Пример 1. Определение менадиона на уровне 10^-8-10^-6 мг/мл по пикам восстановления на фоне 0,2 н. Na₂HPO₄
В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,2 н. раствора Na₂HPO₄. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% (ос. ч. ) в течение 5 мин. Отключают газ и фиксируют катодную вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 20 мВ/с, начиная с потенциала Е_нач=1,0 В. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 0,01 мл стандартного раствора менадиона в концентрации 1,0•10^-5-1,0•10^-3 моль/л, перемешивают 10 с. Съемку вольтамперограммы начинают с потенциала Е_нач=1,0 В. Катодный пик для указанного флавоноида регистрируют в диапазоне потенциала -0,22±0,02 В при чувствительности прибора 1•10^-9 А/мм. Время единичного анализа не превышает 15 мин.

Аналогичные измерения проводили с растворами кверцетина, байкалина, диквертина. Катодные пики соответствующих веществ регистрируют при потенциалах (+0,41±0,04) В, (-0,60±0,03) В, (+0,14±0,02) В.

Пример 2. Определение байкалина на уровне 10^-8-10^-6 мг/мл по пикам окисления на фоне 0,2 н. Nа₂НРO₄
В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,2 н раствора Na₂HPO₄. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% (ос. ч.) в течение 5 мин. Отключают газ и фиксируют анодную вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 20 мВ/с, начиная с потенциала Е_нач.=-1,0 В. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 0,01 мл стандартного раствора байкалина в концентрации 1,0•10^-5-1,0•10^-3 моль/л, перемешивают 10 с. Съемку вольтамперограммы вновь начинают с потенциала Е_нач.=-1,0 В. Анодный пик для указанного флавоноида регистрируют в диапазоне потенциалов (+0,20±0,02) В при чувствительности прибора 1•10^-9 А/мм. Время единичного анализа не превышает 15 мин.

Аналогично регистрируют анодные пики кверцетина, менадиона, диквертина. Анодные пики соответствующих веществ регистрируют при потенциалах (+0,39±0,02) В, (-0,36±0,02) В, (+0,40±0,02) В.

Пример 3. Определение диквертина на уровне 10^-8-10^-6 мг/мл по пикам окисления на фоне 0,2 н. С₆Н₁₄O₇N₂
В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,2 н. C₆H₁₄О₇N₂. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% (ос.ч.) в течение 5 мин. Отключают газ и фиксируют анодную вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 30 мВ/с, начиная с потенциала Е_нач.=-1,0 В. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 0,01мл стандартного раствора диквертина 1,0•10^-5-1,0•10^-3 моль/л, перемешивают 10 с. Съемку вольтамперограммы начинают с потенциала Е_нач.=-1,0 В. Анодный пик для указанного флавоноида регистрируют при потенциале (+0,46±0,01) В при чувствительности прибора 1•10^-9 А/мм. Время единичного анализа не превышает 15 мин.

Аналогичные измерения проводили с растворами кверцетина, менадиона, байкалина. Анодные пики соответствующих веществ регистрируют при потенциалах (+0,36±0,02) В, (-0,15±0,02) В, (+0,35±0,01) В.

Пример 4. Определение кверцетина в экстракте водяники черной по пикам окисления на уровне 10^-8-10^-6 мг/мл
В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,2 н. раствора C₆H₁₄O₇N₂. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% (ос. ч. ) в течение 5 мин. Отключают газ и фиксируют анодную вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 20 мВ/с, начиная с потенциала Е_нач.= -1,0 В. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 0,01 мл раствора экстракта водяники, перемешивают 10 с. Съемку вольтамперограммы начинают с потенциала Е_нач.=-1,0 В. Анодные пики для указанного флавоноида регистрируют в диапазоне потенциалов (+0,36±0,02) В при чувствительности прибора 1•10^-9 А/мм. Концентрацию определяемого вещества оценивали методом добавок аттестованных смесей по общепринятой методике.

Таким образом, дифференциальная вольтамперометрия с использованием стеклоуглеродного электрода позволила существенно улучшить метрологические характеристики анализа флавоноидов. На основании проведенных исследований была показана возможность определения анодных и катодных пиков флавоноидов и разработана экспрессная методика количественного их определения в водных средах. Предел обнаружения, рассчитанный по 3 σ-критерию, равен 1,0•10^-8 моль/л. Минимально определяемая концентрация флавоноидов 3,5•10^-8 моль/л (Sr≤0,20). По сравнению с прототипом чувствительность повышается на 3-4 порядка.

Предложенный способ может быть применен при анализе следовых количеств флавоноидов как в чистых растворах, так и для анализа сложных по составу растительных экстрактов, лекарственных форм, фармакологических препаратов. Вольтамперограммы хорошо воспроизводимы, условия съемки легко могут быть автоматизированы. Методики отличаются простотой исполнения и могут быть использованы в любой лаборатории, имеющей полярограф, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественной и зарубежной электроаппаратуры с компьютерным управлением и обработкой данных.

Предложенный способ может быть применен при анализе следовых количеств флавоноидов как в чистых растворах, так и для анализа сложных по составу растительных экстрактов, лекарственных форм, фармакологических препаратов. Техническим результатом данного изобретения является повышение чувствительности определения флавоноидов, экспрессности и селективности метода дифференциальной вольтамперометрии. Сущность: флавоноиды переводят в раствор путем растворения навески пробы в 70%-ном этиловом спирте при нагревании. Вольтамперометрическое определение ведут на стеклоуглеродном электроде по пикам восстановления при потенциалах от +0,41 до -0,63 В или по пикам окисления при потециалах от -0,36 до +0,46 В, на фонах 0,2 н. Na₂HPO₄ или 0,2 н. C₆H₁₄O₇N₂, регистрацию пиков проводят при линейной скорости развертки потенциала 20-30 мВ/с в дифференциальном режиме съемки вольтамперограммы. Концентрации флавоноидов (кверцетина, диквертина, менадиона, байкалина) определяли по высоте анодных или по высоте катодных пиков. 4 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Способ количественного определения флавоноидов методом дифференциальной вольтамперометрии, включающий перевод флавоноидов в раствор с последующей регистрацией катодных пиков, отличающийся тем, что вольтамперометрическое определение ведут на стеклоуглеродном электроде по пикам восстановления при потенциалах от +0,41 до -0,63 В относительно насыщенного хлоридсеребрянного электрода или по пикам окисления при потециалах от -0,36 до +0,46 В на фонах 0,2 н Na₂HPO₄ или 0,2 н аммония лимоннокислого двузамещенного (C₆H₁₄O₇N₂), регистрацию пиков проводят при линейной скорости развертки потенциала 20-30 мВ/с в дифференциальном режиме съемки вольтамперограммы. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию кверцетина определяют по высоте пиков восстановления при потенциалах +0,37 В на фоне 0,2 н Na₂HPO₄ или при потенциале (+0,33±0,01) В на фоне 0,2 н C₆H₁₄O₇N₂ или по высоте пиков окисления при потенциалах (+0,39±0,02) В, или при (+0,36±0,02) В соответственно на фонах 0,2 н Na₂HPO₄ и 0,2 н C₆H₁₄O₇N₂. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию диквертина определяют по высоте пиков восстановления при потенциалах (+0,14±0,02) В и (-0,40±0,02) В соответственно на фонах 0,2 н Na₂HPO₄ и 0,2 н C₆H₁₄O₇N₂ или по высоте пиков окисления при потенциалах (+0,40±0,02) В и +0,45 В соответственно на фонах 0,2 н Na₂HPO₄ и 0,2 н C₆H₁₄O₇N₂. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию менадиона определяют по высоте пиков восстановления при потенциалах (-0,22±0,02) В и (-0,15±0,02) В соответственно на фонах 0,2 н Na₂HPO₄ и 0,2 н C₆H₁₄O₇N₂ или по высоте пиков окисления при потенциалах -0,34 В и (-0,15±0,01) В соответственно на фонах 0,2 н Na₂HPO₄ и 0,2 н C₆H₁₄O₇N₂. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию байкалина определяют по высоте пиков восстановления при потенциалах (-0,60±0,02) В и -0,60 В соответственно на фонах 0,2 н Na₂HPO₄ и 0,2 н С_бН₁₄О₇К₂ или по высоте пиков окисления при потенциалах (+0,20±0,02) В и (+0,35±0,01) В соответственно на фонах 0,2 н Na₂HPO₄ и 0,2 н C₆H₁₄O₇N₂.