СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРЕПТОМИЦИНА МЕТОДОМ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ Российский патент 2006 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения антибиотика (АБ) стрептомицина, который является производным трисахаридов и представляет 1,3-дигуанидино-2,4,5,6-тетрагидроксициклогексан-2-2-(N-метил-2 глюкозаминозидо)-4-стрептозид.

Стрептомицин относится к антибактериальным веществам и обладает высокой клинической эффективностью в лечении ряда тяжелых инфекций. Его применяют в терапии туберкулеза, туляремии и чумы; в ветеринарии и животноводстве в качестве лечебно-профилактических средств. АБ способен переходить в молоко, мясо животных и оказывать токсическое действие на организм человека. Предельно допустимая концентрация (ПДК) стрептомицина нормируется гигиеническими требованиями безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 и составляет 0,5 ед/г, что соответствует 0,5 мг/кг. Бесконтрольное применение антибиотиков и злоупотребление ими становится с каждым годом все более серьезной проблемой. Поэтому важной задачей современной аналитической химии является совершенствование методов определения антибиотиков, разработка экспрессных и высокочувствительных методик их контроля в сложных по составу объектах.

Старейшими методами обнаружения стрептомицина являются микробиологические методы, позволяющие определять концентрацию антибиотика в биологических объектах и продуктах питания 0,5÷2,0 мг/л [Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ. - Л.: Химия, 1981-624 с., ФС 42-3722-99. Стрептомицина сульфат 0,25 г, 0,5 г и 1,0 г, Свирская С.И. Определение концентрации стрептомицина в жидкостях организма. // Труды АМН СССР. Антибиотики и их применение. - М.: Изд-во АМН СССР, 1952. - Вып.1. - с.79-82]. В основе этих методов лежит способность АБ задерживать рост чувствительных штаммов микроорганизмов. Методики являются сравнительно простыми, но мало специфичны и длительны (время анализа более двух суток), требуют соблюдения стерильности и зачастую прозрачности питательных сред, постоянного контроля тест-микробов.

Известны химические методы определения, основанные на цветных реакциях, характерных для специфических группировок, входящих в молекулу стрептомицина [Мелентьева Г.А. Фармацевтическая химия. - М.: Медицина, 1976. - 828 с.]. Среди них наибольшее распространение получили титриметрические методы анализа: цериметрическое титрование, перманганатометрический метод [Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ. - Л.: Химия, 1981 - 624 с.] определения антибиотика в лекарственных препаратах. Чувствительность таких методов невелика и составляет 10^-4÷10^-3 моль/л.

Широкое распространение в современных лабораториях получили оптические методы определения стрептомицина, основанные на измерении длины волны в максимумах поглощения его окрашенных комплексов или флуоресцирующих продуктов конденсации колориметрическим или флуориметрическими методами [Валединская Л.К. Колориметрический метод определения стрептомицина. // Труды АМН СССР. Антибиотики и их применение. - М.: Изд-во АМН СССР, 1952. - Вып.1. - с.82-84, Калашников В.П., Долотова Т.М., Минка А.Ф. Фотоэлектроколориметрическое определение стрептомицина сульфата. // Фармацевтический журнал. - 2000. - №3. - с.61-63, Шемякин М.М., Хохлов А.С., Колосов М.Н., Бергельсон А.Д., Антонов В.К. Химия антибиотиков. М.: Изд-во АН СССР, 1961. т.1. - 774 с.]. Малая селективность, а также низкая чувствительность (10^-4÷10^-3 моль/л) не позволяет использовать эти методы для определения стрептомицина на уровне микро- и наномолярных концентраций.

Все большее применение в последнее время за рубежом находят хроматографические методы, особенно жидкостная (ЖХ) и высокожидкостная хроматографии (ВЖХГ).

Авторами [Gertraud Suhren, Knappstein Karin. Detection of digidrostreptomycin residues in milk by liquid chromatography and preminary confirmation methods. // Analyst. - 1998. - 123, N12. - P.2797-2801] предложен модифицированный метод жидкостной хроматографии для определения стрептомицина в молоке с использованием твердофазной экстракции на колонках. Для увеличения чувствительности метода использовали флуориметрическое детектирование [Eddes P., Cominobi A., Corvi C.J. Determination of streptomycin residues in food by solidphase extraction and liquid chromatography with post-column derivatization and fluorometric detection. // Chromatogr.A. - 1999. - 830, N2. - P.345-351]. Для выделения определяемого вещества из матрицы применяли экстракцию стрептомицина из образцов проб молока фосфатным буфером [Abbasi Hassan, Hellenäs Karl-Erik. Modified determination of diqidrostreptomycin in Kidney, musche and milk by HPLC. // Analyst. - 1998. - 123, N12. - P.2725-2727.] с последующим осаждением белка и удалении жира органическими экстрагентами или с помощью катионообменных смол. Несмотря на высокую чувствительность методов ЖХ и ВЖХГ (10^-6÷10^-8 моль/л), высокая стоимость приборов, а также длительность анализа с учетом времени пробоподготовки ограничивает их массовое использование.

Возможность полярографического определения стрептомицина и его солей описана в монографии [Мискиджьян С.П., Кравченюк Л.П. Полярография лекарственных препаратов. Киев: Вища школа, 1976. - 232 с.] и основана на восстановлении его альдегидной группы в щелочных средах или на фоне фосфатноцитратного буферного раствора с использованием ртутно-капельного электрода при потенциале полуволны Е_1/2=1,4÷1,5 В относительно насыщенного каломельного электрода (нас.к.э.). Авторы обращают внимание на изменение полярографических кривых со временем, особенно в щелочных растворах. Метод пригоден для анализа антибиотика в чистых препаратах, однако он не позволяет проводить количественное определение на уровне микроконцентраций.

Одним из самых чувствительных электрохимических методов и достаточно простым и дешевым в аппаратурном оформлении является метод вольтамперометрии (ВА) и его высокочувствительный вариант - инверсионная вольтамперометрия (ИВА). Для вольтамперометрического анализа часто допустимы более простые методики предварительного выделения соединений из сложной многокомпонентной смеси чем, например, хроматографические. Пробоподготовка может быть существенно упрощена из-за необязательной дополнительной очистки определяемого вещества перед собственно электрохимическим анализом и возможностью проведения вольтамперометрических измерений в мутных и окрашенных средах.

В литературе имеются единичные работы по применению вольтамперометрического метода в исследовании и анализе стрептомицина. Наиболее близким является метод адсорбционной катодной инверсионной вольтамперометрии на стационарном ртутном капельном электроде [Josept Wang, Jawad S. Mahmoud. Determination of traces of streptomycin and related antibiotics by adsorptive stripping voltammetry. // Analytica Chimica Acta. - 1986. - 186. - P.31-38] (прототип). Определение стрептомицина основано на его способности накапливаться на стационарном ртутном капельном электроде при потенциале - 1,2 В за счет адсорбции в течение 60-300 с с последующим электрохимическим восстановлением накопленного вещества на фоне 0,01 М NaOH в дифференциальном импульсном режиме при скорости развертки потенциала 50 мВ/с. При этом на вольтамперограмме регистрировали два пика с потенциалами -1,58 и -1,70 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода (нас.х.с.). Для количественного определения использовали пик с потенциалами -1,58 В.

Нижняя граница определяемых опытным путем содержаний C_H=1·10^-8 моль/л, относительное среднеквадратичное отклонение для концентрации 4·10^-8 моль/л равно 5,1%.

Показана возможность определения стрептомицина в моче на уровне 1·10^-6 моль/л (и более) после разбавления мочи 0,01 М NaOH. Авторы отмечали, что для определения более низких концентраций лекарственного вещества в моче (<1·10^-6 моль/л) или в других жидкостях организма, требуются разработки процедуры пробоподготовки вместо шага разбавления.

В данных условиях определение стрептомицина в сложных природных и биологических смесях, пищевых продуктах, сточных водах, невозможно на уровне наномолярных концентраций. Поэтому разработка экспрессных, селективных и высокочувствительных методов определения стрептомицина в сложных смесях представляет интерес.

Задачей заявляемого изобретения является снижение минимально определяемой опытным путем концентрации, повышение селективности и экспрессности определения стрептомицина методом анодной инверсионной вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что стрептомицин переводят из пробы в раствор и проводят электрохимическое концентрирование на стеклоуглеродном электроде (СУ) с последующей регистрацией вольтамперограмм. Новым в способе является то, что проводят накопление стрептомицина в перемешиваемом растворе в течение 90÷180 с при потенциалах электролиза Е_Э=-(0,10÷0,20) В на фоне (0,1÷0,2)н. раствора гидрофосфата натрия с последующей регистрацией анодных пиков в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при скорости развертки потенциала (15÷25) мВ/с и концентрацию стрептомицина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов от 0,66 до 0,70 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода (нас.х.с.э.) методом добавок аттестованных смесей.

В прототипе количественное определение стрептомицина основано на реакции восстановления антибиотика на стационарном ртутном капельном электроде.

В предлагаемом способе впервые установлена способность стрептомицина окисляться на стеклоуглеродном электроде (СУ). Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов как в водных, так и в неводных средах, а также простотой механического обновления поверхности и требованиями техники безопасности. Ртуть токсична и может вредно влиять на чувствительные биологические материалы. Реакция электроокисления стрептомицина на СУ является электрофильной. Роль электрофильного реагента с электронным дефицитом выполняет анод, а субстрата - органическая молекула. Способность к окислению существенно зависит от материала электрода и состояния его поверхности. Стрептомицин достаточно легко окисляется и на других типах графитовых электродов (на электродах, пропитанных полиэтиленом с парафином в вакууме или эпоксидной смолой), но они меньше удовлетворяли требованиям чисто аналитической практики из-за большого остаточного тока. Для определения антибиотика использовали «игольчатые» по форме индикаторные электроды (СУ) после предварительного электрохимического модифицирования их поверхности. Такая обработка приводит к улучшению воспроизводимости вольтамперометрических измерений. СУ электрод впервые использован для определения стрептомицина.

В прототипе описано использование в качестве фона 0,01 М NaOH. При этом на вольтамперограмме регистрировали два катодных пика с близкими потенциалами -1,58 и -1,70 В, что существенно снижает селективность определения. Кроме того, пики регистрируют вблизи разряда фона, вследствие чего ухудшается воспроизводимость.

Определение стрептомицина по анодным пикам на фоне 0,01 М NaOH невозможно, что, по-видимому, связано с формой нахождения вещества в растворе. В предлагаемом заявленном изобретении фоне (0,1÷0,2)н. гидрофосфата натрия (Na₂HPO₄) регистрируется при съемке вольтамперной кривой только один анодный пик при потенциале (0,66÷0,70) В относительно нас.х.с.э. в широком диапазоне определяемых концентраций от 7,0·10^-9 до 1,0·10^-7 моль/л с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение S_r для диапазона концентраций (1÷4)·10^-8 моль/л составляет 0,030÷0,025, т.е. <3,0% против 5,1% в прототипе для концентрации 4·10^-8 моль/л. Возможность электрохимического поведения определяемого вещества очень сильно зависит от природы и концентрации фонового электролита. Фон (0,1÷0,2)н. Na₂HPO₄ подобран экспериментально и соответствует рН≈8,0÷8,6. При этих значениях рН стрептомицин находится в устойчивой форме и способен окисляться на СУ электроде в водных средах. При концентрации раствора Na₂HPO₄<0,1н. (т.е. при рН<8,0) регистрация пиков окисления затруднена, а при концентрации Na₂HPO₄>0,2н. (рН>8,6) пики практически не получены. По-видимому, при рН>8,6 происходит щелочной гидролиз стрептомицина и распад его молекулы с образованием электрохимически неактивного мальтола.

Абсолютной новизной является экспериментально подобранный фон Na₂HPO₄ и установленные значения его концентрации (0,1÷0,2)н. и значения рН (8,0÷8,6).

Другим отличительным признаком являются установленные условия электрохимического накопления: потенциал электролиза Е_Э=-(0,10÷0,20) В. Опытные данные показали зависимость тока пика окисления стрептомицина от Е_Э (табл.). Величина тока увеличивалась и достигала максимального значения в области потенциалов -(0,10÷0,20) В. При -0,20>Е_Э>-0,10 В уменьшалась величина тока окисления органического вещества.

Использование предварительного электролиза при значениях потенциала -(0,10÷0,20) В позволяет регистрировать вольтамперограммы с четко выраженным максимумом, и это позволяет повысить точность, разрешающую способность способа и экспрессно определять концентрацию менее 1·10^-7 моль/л стрептомицина в сложных по составу смесях.

Время предварительного электролиза (τ_Э) выбирают в зависимости от концентрации определяемого вещества. Максимальное значение величины тока окисления достигается при τ_Э, равном 90÷180 с. При τ_Э<90 с снижается чувствительность определения и увеличивается ошибка определения, а при τ_Э>180 с наблюдалось полное насыщение поверхности электрода и величина тока более не зависела от времени накопления. Поэтому использование τ_Э>180 с приводит к снижению экспрессности. Без предварительного адсорбционного накопления фиксировать четкие пики определяемого вещества при концентрации <10^-7 моль/л невозможно.

Важным для определения стрептомицина является выбор скорости развертки потенциала. Оптимальной является скорость 15÷25 мВ/с. Увеличение скорости более 25 мВ/с увеличивает чувствительность, но при этом растет остаточный ток и может появляться на вольтамперной кривой дополнительный небольшой предпик при потенциале 0,5 В, что приводит к уменьшению разрешающей способности способа и затрудняет обработку аналитического сигнала. Использование скорости <15 мВ/с существенно снижает величину анодного тока и понижается чувствительность определения. При скорости 15÷25 мВ/с происходит практически полная десорбция вещества с поверхности электрода.

Нижняя граница определяемых содержаний стрептомицина зависит от режима съемки вольтамперных кривых. В дифференциальном режиме высокая точность определяется тем, что потенциал пика измеряется в точке, в которой круто падающая первая производная пересекает нулевую линию. Использование режима дифференцирования позволяет фиксировать четкие пики и разрешает обнаружение стрептомицина даже на уровне наномолярных концентраций. Для определения стрептомицина он ранее не применялся. При линейном наложении потенциала в интегральном режиме определение концентрации стрептомицина на уровне n·10^-8 моль/л практически не возможно из-за большого значения остаточного тока, особенно в многокомпонентных смесях. Поэтому для количественного определения стрептомицина рекомендован дифференциальный режим съемки вольтамперограмм.

Таким образом, установленные условия впервые позволили количественно определять стрептомицин на основе реакции электроокисления с использованием нетоксичного стеклоуглеродного электрода (в прототипе использован стационарный ртутный капельный электрод). Для повышения чувствительности определения использовали предварительное адсорбционное электроконцентрирование на поверхности СУ электрода. Предлагаемый вольтамперометрический способ позволил повысить селективность определения и существенно улучшить обработку вольтамперограмм при анализе за счет регистрации одного анодного пика и установленных оптимальных условий проведения электродного процесса. Относительное стандартное отклонение не превышает 3% против 5,1% для концентрации 4·10^-8 моль/л.

Предел обнаружения, рассчитанный по 3σ-критерию, равен 5,3·10^-10 моль/л при τ_Э=180 с (в прототипе 7·10^-10 моль/л при τ_Э=300 с, однако в прототипе не приводятся данные, по каким критериям рассчитан теоретический предел обнаружения).

Определению не мешают вещества, присутствие которых возможно в биологических объектах: аскорбиновая и мочевая кислоты, витамины B₁ В₂, РР, Вс, ионы Zn²⁺, Cu²⁺, Pb²⁺, Ca²⁺.

Пример 1. Определение стрептомицина на уровне 10^-9÷10^-8 моль/л

В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,2н. раствора гидрофосфата натрия. Удаляют из раствора кислород струей очищенного азота с содержанием кислорода менее 0,001% в течение пяти минут. Не прекращая перемешивания, проводят электролиз раствора при условии: Е_Э=-0,20 В, τ_Э=90 с. Отключают газ и фиксируют анодную дифференциальную вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 15 мВ/с, начиная с потенциала Е_нач.=+0,30 В. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 0,01 мл аттестованной смеси стрептомицина 2·10^-6÷10^-5 моль/л, перемешивают раствор 10 с и проводят электрохимическое концентрированно антибиотика при Е_Э=-0,20 В, τ_Э=90 с. Съемку вольтамперной кривой начинают с потенциала +0,30 В. Пик для указанной концентрации вещества регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,66 до 0,70 В (нас.х.с.э.) при чувствительности прибора 1·10^-10 А/мм. Время единичного анализа не превышает 10 минут.

Предлагаемый способ впервые применен нами для определения стрептомицина в молоке. Для освобождения антибиотика и устранения мешающего влияния белка использовали кислотный гидролиз и осаждение водорастворимого белка из гидролизата с последующим вольтамперометрическим определением стрептомицина в безбелковом гидролизате путем регистрации анодных пиков на СУ электроде в условиях предлагаемого нами способа (в прототипе молоко и молочные смеси не анализировались).

Пример 2. Определение стрептомицина в молоке

В коническую колбу вместимостью 100,0 см³ вносят 25,0 см³ молока и 1 мл (6-7 моль/л) HCl порциями по 0,2 см³. Смесь встряхивают в течение 15 минут. Затем к смеси добавляют 3-4 г (NH₄)₂SO₄ порциями в 2-3 приема. Снова встряхивают содержимое колбы в течение 10 минут. Полученную смесь переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 15 минут при скорости 6000 об/мин. Центрифугат отфильтровывают через двойной бумажный фильтр в коническую колбу вместимостью 100,0 см³. Доводят рН фильтрата до 8 раствором (4-5)н. NaOH. Полученный раствор является подготовленной пробой для анализа. Аликвоту пробы объемом 1-3 см³ помещают в электролизер, добавляют фоновый электролит (0,1÷0,2)н. раствор Na₂HPO₄ до 10 см³ и затем проводят вольтамперометрические измерения при условиях: потенциал электролизера Е_Э=-0,10В, время электролиза τ_Э=180 с, скорость развертки потенциала 25 мВ/с. Анодный пик стрептомицина регистрируют с использованием стеклоуглеродного электрода в диапазоне потенциалов (0,66÷0,70) В при чувствительности прибора 1·10^-10A/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Содержание антибиотика оценивают методом добавок аттестованных смесей. Время анализа одной пробы с учетом пробоподготовки не превышает 60 минут.

Предложенный способ прост, экспрессен, селективен, высокочувствительный (позволяет определять стрептомицин в молоке на уровне ПДК или 0,5 мг/кг), может быть применен не только для контроля качества сырья пищевых продуктов (молока, молочных смесей, творога, мяса), но и для анализа антибиотика в биологических жидкостях (крови, плазме, лимфе, моче), а также при анализе лекарственных форм в технологических средах и сточных водах производства стрептомицина и родственных ему соединений. Методики с использованием предлагаемого способа легко могут быть автоматизированы, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественной электронной аппаратуры с компьютерным управлением и обработкой данных (типа СТА, ТА, ВАМ и др.). Способ может быть использован не только в научных исследованиях, но и в широкомасштабном серийном аналитическом контроле.

Таблица
Зависимость величины тока окисления стрептомицина от потенциала электролиза (С=0,8 мг/дм³, фон 0,2 и Na₂HPO₄) W=15 мВ/с, τ_Э=90 сЕ_Э,В-0,300-0,200-0,1000,000+0,100+0,200+0,300+0,4000,3800,4100,4200,3970,2030,1820,1780,145

Изобретение относится к области аналитической химии. Технический результат изобретения: повышение селективности, экспрессности, снижение минимально определяемой концентрации стрептомицина. Сущность: стрептомицин переводят из пробы в раствор и проводят вольтамперометрическое определение в перемешиваемом растворе в течение 90÷180 с при потенциалах электролиза - (0,10÷0,20) В на фоне (0,1÷0,2)н. раствора гидрофосфата натрия с последующей регистрацией анодных пиков в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при скорости развертки потенциала 15÷25 мВ/с, а концентрацию стрептомицина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов от 0,66 до 0,70 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода методом добавок аттестованных смесей. 1 табл.

Способ количественного определения стрептомицина методом адсорбционной инверсионной вольтамперометрии, заключающийся в том, что стрептомицин переводят из пробы в раствор и проводят вольтамперометрическое определение, отличающийся тем, что проводят накопление стрептомицина в перемешиваемом растворе в течение 90÷180 с при потенциалах электролиза -(0,10÷0,20) В на фоне (0,1÷0,2) н раствора гидрофосфата натрия с последующей регистрацией анодных пиков в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при скорости развертки потенциала 15÷25 мВ/с и концентрацию стрептомицина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов от 0,66 до 0,70 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода методом добавок аттестованных смесей.