СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА E (α-ТОКОФЕРОЛ АЦЕТАТА) МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ Российский патент 2002 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к вольтамперометрическому способу определения витамина Е (α-токоферола ацетата или 6-ацетокси-2-метил-2-(4,8,12-триметил-тридецил)-хромана). Витамин Е является природным антиоксидантом, участвует в биосинтезе белков, тканевом дыхании клеток, обеспечивает регулирующее и стимулирующее влияние на гипофизные и половые органы [Рысс С. М. Витамины. Ленинград: Госуд. изд-во медицинской лит-ры, 1963].

Определение микроколичеств токоферола важно для оценки качества пищевых продуктов, сырья, сельскохозяйственных кормов, идентификации действующих веществ в лекарственных формах. Поэтому аналитическая практика предъявляет повышенные требования к разработке экспрессных и высокочувствительных методов определения витамина.

Широкое распространение в анализе токоферола получили колориметрические методы: азотнокислый Фуртера-Мейера и железо-пиридиновый Эммери-Энгеля. Эти методы длительны, мало специфичны, требуют большого количества дорогостоящих реактивов и часто дают завышенные результаты.

Описаны методы бумажной, тонкослойной, газовой, газожидкостной и колоночной хроматографии, применяемые для характеристики изомерного состава токоферолов в природных источниках [Надиров Н.К. Токоферолы (витамины группы Е) - биологически активные вещества. - М.: Знание, 1981. -64с.].

Метод газожидкостной хроматографии ГЖХ использовали в анализе лекарственных препаратов, содержащих витамин Е. Токоферол выделяли щелочным омылением масляного раствора с дальнейшей экстракцией неомыленной части. Показана плохая воспроизводимость результатов анализа вследствие малого выхода витамина [Грибанова С.В, Харитонов Ю.Я., Джабаров Д.Н., Руденко Б.А. Определение витамина Е (α-токоферилацетата) в лекарственных препаратах методом капиллярной газовой хроматографии. // Фармация, - 1992, Т.41, N5. С.32-36].

Для определения жирорастворимых витаминов в последнее время широко используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектированием. Анализ проводили в градиентном и изократическом режимах как в нормально-фазовых, так и в обращенно-фазовых условиях [Прохватилова С.С. Определение витамина Е в фармацевтических препаратах методом ВЭЖХ. // Фармация, - 1998. N3. С.41]. Несмотря на высокую чувствительность метода ВЭЖХ (10^-5-10^-6 мг/мл) длительность анализа, а также высокая стоимость приборов и реактивов существенно ограничивают его использование.

Электрохимическому исследованию токоферола посвящены единичные работы. Амперометрическое титрование витамина Е раствором хлорида золота (III) не пригодно для анализа лекарственных препаратов из-за малой специфичности. Для определения суммы токоферолов в концентратах предложен метод амперометрического титрования в среде 1 н. раствора серной кислоты в 75%-ном этаноле раствором сульфата церия (IV) с помощью платинового электрода [Мискиджьян С. П. , Кравченюк Л. П. Полярография лекарственных соединений. - Киев: Вища школа. - 1976, 232 с.].

Определение витамина Е полярографическим методом возможно в виде его окисленной формы - токоферилхинона. Показано определение α-токоферола по прямолинейной зависимости высоты волны от концентрации токоферилхинона [Мискиджьян С. П., Кравченюк Л.П. - 1976]. Наиболее близким является прямой полярографический метод определения витамина Е в чистых фоновых растворах с использованием ртутного капельного индикаторного электрода (прототип). Сущность методики состоит в получении анодной волны токоферилацетата в области положительных потенциалов. Полярографическую волну определяемого вещества регистрировали при потенциале Е_1/2= 1,33 В относительно насыщенного каломельного электрода (нас.к.э.). В качестве фона использовали раствор хлората лития (LiClO₄) в ацетонитриле, концентрация фонового электролита не указана. Предел обнаружения не указан [Мискиджьян С.П., Кравченюк Л.П. - 1976]. Минимальная определяемая концентрация жирорастворимых витаминов этим методом практически равна 10^-4-10^-5 моль/л. В данных условиях определение витамина Е на уровне 10^-6-10^-7 моль/л невозможно.

Метод дифференциальной вольтамперометрии ДВА отвечает современным требованиям к контролю качества разнообразных и сложных по составу систем благодаря высокой чувствительности и низкой стоимости анализа.

Информации о применении метода вольтамперометрии для определения токоферола в литературе практически нет, поэтому разработка экспрессных и высокочувствительных методик определения жирорастворимых витаминов продолжает представлять интерес.

Задачей заявляемого изобретения является повышение чувствительности, экспрессности и селективности определения витамина Е методом анодной дифференциальной вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что масляный раствор токоферола растворяют в хлороформе, разводят ацетонитрилом с последующим вольтамперометрическим определением. Новым в способе является то, что вольтамперометрическое определение ведут по пикам окисления на стеклоуглеродном, углеситаловом или графитовом электродах в растворе ацетонитрила на фонах 0,02 М хлората тетраметиламмония ((СН₃)₄NClO₄), 0,02 М иодида тетрабутиламмония ((C₄H₉)₄NJ), регистрацию анодных пиков проводят в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при линейной скорости развертки потенциала 10-20 мВ/с и концентрацию витамина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов 1,8-2,0 В относительно донной ртути.

В прототипе описано окисление токоферола на ртутном капельном электроде. Впервые установлена возможность электроопределения витамина на угольных электродах. В качестве индикаторных применяли три типа углеродных электродов - графитовый (Г), пропитанный полиэтиленом с парафином в вакууме, углеситаловый (УС) и стеклоуглеродный (СУ). Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов как в водной, так и в неводной средах, а также простотой механического обновления поверхности. Угольные электроды из стеклоуглеродных материалов являются наиболее перспективными в электроаналитической химии вообще и в инверсионной ее области в частности. Электроды из стеклоуглерода обладают высокой химической устойчивостью, беспористостью и высокой твердостью. В настоящее время налажен промышленный выпуск электродов из СУ, что не требует от исследователей собственных усилий по их приготовлению [Брайнина Х.З., Нейман Е.Я., Слепушкин В.В. Инверсионные электроаналитические методы. -М. : Химия, 1998, С.239]. В отличие от ртутного капельного электрода, электроды из углеродных материалов не токсичны. Зависимость тока окисления от концентрации токоферола на разных типах углеродных электродов представлена в таблице.

Из таблицы видно, что легче всего токоферол окисляется на графитовом электроде. Это, по-видимому, связано с разной степенью адсорбируемости на гексагонах графита, имеющих π-зонную структуру. Структурное подобие материала графитового электрода, вероятно, благоприятствует переходу электронов при меньшем значении потенциала, чем на СУ и УС электродах. Однако СУ электрод оказался более удобным в работе из-за малой величины остаточного тока и более высокой чувствительности.

Другим отличительным признаком является определение токоферола в растворах солей тетраалкиламмония. Определение витамина Е в ацетонитриле на фоне LiClO₄ затруднено из-за плохой растворимости масляного раствора токоферола в ацетонитриле и низкой чувствительности определения.

Предлагаемые в заявленном изобретении фоны 0,02 М (СН₃)₄NJ; 0,02 М (C₂H₅)₄NJ; 0,02 М (C₄H₉)₄NJ; 0,02 М (CH₃)₄NClO₄ позволяют определять токоферол на уровне 10^-6-10^-7 моль/л с хорошей воспроизводимостью. Некоторые метрологические характеристики, коэффициенты градуировочных графиков определения витамина Е на СУ электроде представлены на чертеже (1-0,02 М (CH₃)₄NJ; 2-0,02 M (C₂H₅)₄NJ; 3-0,02 М (C₄H₉)₄NJ; 4-0,02 M (CH₃)₄NClO₄).

Таким образом, оптимальным фоновым электролитом при определении витамина Е вольтамперометрическим методом является 0,02 М (CH₃)₄NClO₄. Ранее метод ДВА на фоне 0,02 М (CH₃)₄NClO₄ для количественного химического анализа токоферола не применялся.

Важным при определении токоферола является использование дифференциального режима съемки вольтамперограмм. Существенным преимуществом такого вида съемки служит возможность получения высоких пиков, облегчающих расшифровку вольтамперограмм и уменьшающих ошибку измерения величины сигнала.

Определение витамина Е методом ДВА проводили с линейной скоростью развертки потенциала 10-20 мВ/с. Увеличение скорости более 20 мВ/с увеличивает чувствительность, но при этом растет остаточный ток и уменьшается разрешающая способность метода. При скорости менее 10 мВ/с снижается величина анодного тока и понижается чувствительность определения. Значение используемой скорости в прототипе не приведено.

Таким образом, подобранные условия впервые позволили количественно определять токоферол с высокой чувствительностью на уровне 8,3•10^-7 моль/л. Диапазон определяемых содержаний от 8,3•10^-7 моль/л до 7,0•10^-6 моль/л. Определению не мешают водорастворимые витамины С, В₁, В₂, РР, В₆, жирорастворимые А, Д, К.

Пример 1. Определение витамина Е на уровне 2,0 мг/дм³.

В стаканчик вместимостью 20 см³ приливают 10 см³ 0,02 М раствора (СН₃)₄NClO₄ в ацетонитриле. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% (ос.ч.) в течение 5 мин, отключают газ и фиксируют анодную вольтамперограмму в дифференциальном режиме при скорости развертки потенциала 10 мВ/с, начиная с потенциала Е=1,3 В относительно донной ртути. Отсутствие пиков на вольтамперограмме свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 0,02 см³ аттестованного раствора витамина Е концентрации 1000 мг/дм, перемешивают током азота 10 с и проводят съемку вольтамперограммы начиная с потенциала Е=1,3 В. Анодный пик для указанной концентрации витамина регистрируют в диапазоне потенциалов от 1,8 до 2,0 В при чувствительности прибора 5•10^-9 А/мм. Затем в стаканчик с анализируемым раствором вносят добавку аттестованного раствора витамина Е в том же объеме (V_доб=0,02 см³, С_доб=1000 мг/дм³), перемешивают и регистрируют вольтамперограмму в тех же условиях. Концентрацию определяемого вещества оценивают по высоте пика методом добавок аттестованных смесей по общепринятой методике.

Пример 2. Определение витамина Е в витаминно-минеральной добавке "Иван Иваныч".

Навеску подкормки массой 0,5 г, взятой с точностью до 0,01 г, переносят в стаканчик вместимостью 100 см³, добавляют 5 см³ хлороформа, перемешивают и далее небольшими порциями приливают 25 см³ ацетонитрила. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. Все операции по подготовке пробы следует проводить в вытяжном шкафу. Из полученного фильтрата для вольтамперометрических измерений берут аликвоту пробы объемом 0,5 см³.

В стаканчик вместимостью 20 см³ приливают 9,5 см³ 0,02 М раствора (CH₃)₄NClO₄ в ацетонитриле. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% (ос.ч.) в течение 5 мин, отключают газ и фиксируют анодную вольтамперограмму в дифференциальном режиме при скорости развертки потенциала 20 мВ/с, начиная с потенциала Е=1,3 В относительно донной ртути. Отсутствие пиков на вольтамперограмме свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют аликвоту пробы, полученную вышеизложенным способом, перемешивают током азота 10 с и проводят съемку вольтамперограммы начиная с потенциала Е= 1,3 В. Анодный пик для указанной концентрации витамина регистрируют в диапазоне потенциалов от 1,8 до 2,0 В при чувствительности прибора 5•10^-9 А/мм. Концентрацию определяемого вещества оценивают по высоте пика методом добавок аттестованных смесей по общепринятой методике. Время анализа одной пробы не превышает 15 мин.

Таким образом, дифференциальная вольтамперометрия с использованием стеклоуглеродного электрода позволила существенно улучшить метрологические характеристики анализа токоферола. Предел обнаружения, рассчитанный по 3σ-критерию равен 8,3-10^-7 моль/л. Минимально определяемая концентрация токоферола 1,8•10^-6 моль/л (S_r≤0,2). На основании проведенных исследований показана возможность определения токоферола по пикам окисления в растворах на уровне 10^-6-10^-7 моль/л и разработана экспрессная методика количественного определения витамина в кормовых смесях и витаминизированных подкормках.

Предложенный способ может быть применен при анализе микроконцентраций токоферола как в чистых растворах, так и в сложных по составу фармакологических препаратах, сельскохозяйственных кормах, пищевых продуктах, биосистемах (крови, лимфе, плазме). Дифференциальные вольт-амперограммы хорошо воспроизводимы, условия съемки могут быть легко автоматизированы. Методика отличается простотой исполнения и может быть использована в любой лаборатории, имеющей полярограф, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественных вольтамперометрических компьютеризированных комплексов типа СТА, ХАН, ВОЛАН.

Способ может быть применен при анализе микроколичеств токоферола как в чистых растворах, так и в сложных по составу фармакологических препаратах, сельскохозяйственных и пищевых продуктах, биосистемах, биологически активных добавках, сточных водах жироперерабатывающих предприятий. Техническим результатом изобретения является повышение чувствительности, экспрессности и селективности определения витамина методом дифференциальной вольтамперометрии. Сущность: масляный раствор токоферола растворяют в хлороформе, разводят ацетонитрилом с последующим вольтамперометрическим определением. Новым в способе является то, что вольтамперометрическое определение ведут по пикам окисления на стеклоуглеродном, углеситаловом или графитовом электродах в растворе ацетонитрила на фонах 0,02 М хлората тетраметиламмония ((СН₃)₄ NClO₄), 0,02 М иодида тетрабутиламмония ((C₄H₉)₄NJ), регистрацию анодных пиков проводят в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при линейной скорости развертки потенциала 10-20 мВ/с и концентрацию витамина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов 1,8-2,0 В относительно донной ртути методом добавок аттестованных смесей. 1 ил., 1 табл.

Способ количественного определения витамина Е методом дифференциальной вольтамперометрии, заключающийся в том, что масляный раствор токоферола растворяют в хлороформе, разводят ацетонитрилом с последующим вольтамперометрическим определением, отличающийся тем, что вольтамперометрическое определение ведут по пикам окисления на стеклоуглеродном, углеситаловом или графитовом электродах в растворе ацетонитрила на фонах 0,02 М хлората тетраметиламмония ((СН₃)₄ NClO₄), 0,02 М иодида тетрабутиламмония ((C₄H₉)₄NJ), регистрацию анодных пиков проводят в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при линейной скорости развертки потенциала 10-20 мВ/с и концентрацию витамина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов 1,8-2,0 В относительно донной ртути методом добавок аттестованных смесей.