СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/571 A61K39/05 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для серологической диагностики сифилиса, касается способа получения специфического антигена - сенситина для твердой фазы при конструировании иммуноферментной тест-системы.

Известен способ получения рекомбинантных сенситинов из Treponema pallidum для иммуноферментного анализа, включающий выделение гена из Treponema pallidum, ответственного за продукцию специфического белка возбудителя с молекулярной массой (М.м) 41 кД, или 17 кД, который встраивают в кольцевую ДНК Е. coli или дрожжевых клеток, с получением трансформированных клеток - продуцентов специфических белков Treponema pallidum и последующей многоступенчатой очисткой целевого продукта. Однако известный метод предполагает использование при конструировании иммуноферментных тест-систем рекомбинантных белков - сенситинов с М.м. либо 41 кД, либо 17 кД, либо смесь этих белков ("РекомбиБест - антипаллидум" АО "Вектор - Бест"; "Рекомбинант - сифилис" ФАО "Ферейн"; "ЭКОлаб - антипаллидум - скрин" ТОО "ЭКОлаб"; Киселева, В. Н. Беднова, Г.А. Дмитриев Г.А. Постановка иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса. Вести. дерматологии 1998, 1, с. 39-41).

Тем не менее, данный способ не обеспечивает достаточную чувствительность тест-системы, в которой они использованы, так как в сенситине представлены не все антигенные детерминанты Treponema pallidum, которые обусловливают взаимодействие со всем спектром специфических антител, образующихся на антигенные детерминанты возбудителя.

Наиболее близким аналогом является способ получения трепонемных сенситинов для иммуноферментных тест-систем при помощи ультразвуковой дезинтеграции Treponema pallidum, включающий культивирование патогенных трепонем в тестикулах кроликов, многоступенчатую очистку трепонемной взвеси и выделение поверхностных антигенов при помощи ультразвуковой обработки. Полученный ультрасоникат используют в качестве сенситина для твердой фазы. На основе обработанных ультразвуком сенситинов созданы иммуноферментные тест-системы, такие как "ИФА АНТИ ЛЮИС" НПО "Диагностические системы". Нижний Новгород; "Т. pure" Lee laboratories" США. (А.П. Обрядина, Н.В. Фриго, В.Д Комарова и др. Ультраозвученные белки Treponema pallidum и их рекомбинантные аналоги в иммуноферментной диагностике сифилиса, ИППП 1999, 1, с. 25-28).

Недостатком указанного метода является использование всей дезинтегрированной микробной клетки, в которой присутствуют и белки, не несущие специфической активности, что снижает специфичность иммуноферментных тест-систем на их основе.

Технический результат изобретения заключается в повышении технологичности и специфической активности трепонемного сенситина.

Сущность изобретения заключается в следующем: очищенную трепонемную взвесь, инактивируют прогреванием при температуре (55±3)^oС в течение (30±2) мин или нейтральным формалином в конечной концентрации (0,6±0,2)% в течение (84±12) ч, центрифугируют при 2500 g в течении (60±5) мин и проводят обработку ионным детергентом SDS - в концентрации (1,5±0,5)% в течение (30±2) мин при температуре (60±2)^oС или неионным детергентом - Тритоном Х-100 - в конечной концентрации (0,3±0,1)% в течение (30±2) мин при температуре (38±2)^oС, с последующим центрифугированием при 200 g в течение (60±5) мин.

Предварительная инактивация трепонемной взвеси прогреванием при температуре (55±3)^oС в течение (30±2) мин или инактивация нейтральным формалином в конечной концентрации (0,6±0,2)% в течение (84±12) ч стабилизирует поверхностные мембранные белки патогенных трепонем.

Последующее центрифугирование инактивированной трепонемной взвеси при 2500 g в течение (60±5) мин позволяет устранить тканевой дебрис и получить плотный осадок очищенных корпускул возбудителя.

Обработка ионным детергентом-SDS - в концентрации (1,5±0,5)% в течение (30±2) мин при температуре (60±2)^oС или обработка неионным детергентом - Тритоном Х-100 - в конечной концентрации (0,3±0,1)% в течение (30±2) мин при температуре (38±2)^oС, с последующим центрифугированием при 200 g в течение (60±5) мин, позволяет получить трепонемный сенситин. который содержит комплекс специфических мембранных белков патогенных трепонем с М.м. 66, 47-48, 41, 35 и 17 кД, обладающих специфической активностью, что повышает чувствительность и специфичность созданной на их основе иммуноферментной тест-системы, позволяющей определять специфические антитела при различных формах сифилитической инфекции.

Способ осуществляется следующим образом:
Пример 1. Кроликов-самцов породы Шиншилла весом 3,5-4,0 кг заражают интратестикулярно (в каждый тестикул) взвесью Treponema pallidum штамм Никольс по 1,0 мл с концентрацией (500±50 млн. микробных тел/мл). На 7-10 сутки после заражения на высоте специфического орхита кроликов усыпляют и извлекают тестикулы. Тестикулы измельчают, гомогенизируют и готовят взвесь на 0,9% растворе хлорида натрия, которую подвергают дифференциальному центрифугированию при 60 g в течение 5 мин. Взвесь инактивируют прогреванием при температуре (55±3)^oС в течение (30±2) мин, затем вновь центрифугируют при 2500 g в течение 1 ч. После заключительного центрифугирования осадок патогенных трепонем обрабатывают подогретым до температуры (38±2)^oС в конечной концентрации (0,3±0,1)% раствором неионного детергента-Тритона Х 100 в течение (30±2) мин при соотношении объемов детергента и осадка 0,5:1,0. Полученную суспензию осаждают при 200 g, затем надосадочную жидкость используют в качестве целевого продукта (тритоновый вариант).

Пример 2. Культуру Treponema pallidum штамм Никольс и ее взвесь получают, как описано в примере 1. Затем проводят инактивацию нейтральным формалином в конечной концентрации (0,6±0,2)% в течение (84±12) ч. Осадок патогенных трепонем получают, как описано выше, и обрабатывают 1-2% раствором ионного детергента-SDS - додецилсульфатом натрия (концентрация детергента зависит от концентрации возбудителя в суспензии). Обработанную SDS надосадочную жидкость оставляют в термостате при температуре (60±2)^oС, после чего подвергают центрифугированию при 200 g. Надосадочная жидкость представляет собой SDS - вариант целевого продукта.

Специфическую активность предлагаемых сенситинов оценивали в твердофазном варианте иммуноферментного анализа (ИФА), который проводили по общепринятой схеме.

Полученные сенситины сорбировали в лунках полистироловых планшетов по 100 мкл, разведения сенситинов готовили на фосфатном солевом буферном растворе рН 7,1±0,1. Сорбцию сенситинов проводили в течение (18±1) ч при 4^oС.

Реакцию оценивали визуально и спектрофотометрически при длине волны 492 нм.

Данные по сравнительной оценке специфической активности трепонемных антигенов, приготовленных различными способами и предлагаемому способу в иммуноферментном анализе с использованием положительных, отрицательных и ложноположительных на сифилис сывороток, свидетельствуют о более высокой специфической активности по сравнению с рекомбинантными антигенами (Таблица 1).

Разработанный способ получения трепонемных антигенов-сенситинов может быть использован для конструирования иммуноферментной тест-системы, предназначенной для серологической диагностики различных форм сифилиса (Таблица 2).

Как видно из представленных в таблице 1 данных, и "Тритоновый" и "SDS" варианты сенситинов обладают достаточно высокой специфической активностью по сравнению с рекомбинантными аналогами 41 и 17 кД и имеют примерно одинаковую активность в сравнении с рекомбинантной смесью. ("Тритоновый" с.2 и "SDS" с. 3)
Как видно из таблицы 2, оптическая плотность сывороток при различных формах сифилиса, исследованных на нашей тест-системе с различными вариантами сенситинов, в большинстве случаев выше, чем на тест-системе на основе рекомбинантных сенситинов, что говорит о более высокой чувствительности специфической активности трепонемных сенситинов.

Предложенный нами способ воспроизводим и исключает необходимость использования дорогостоящего оборудования, что приводит к повышению его технологичности.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для серологической диагностики сифилиса. Сущность изобретения состоит в том, что очищенную трепонемную взвесь подвергают инактивации при температуре (55±3)^oС в течение (30±2) мин или нейтральным формалином в конечной концентрации (0,6±0,2)% в течение (84±12) ч, центрифугированию при 2500 g в течение (60±5) мин и обрабатывают ионным детергентом - SDS - в концентрации (1,5±0,5)% в течение (30±2) мин при температуре (60±2)^oС или неионным детергентом - тритоном Х-100 - в конечной концентрации (0,3±0,1)% в течение (30±2) мин при температуре (38±2)^oС, с последующим центрифугированием при 200 g в течение (60±5) мин. Техническим результатом является повышение технологичности и специфической активности трепонемного сенситина. 2 табл.

Способ получения трепонемных антигенов для иммуноферментного анализа, включающий культивирование патогенных трепонем в тестикулах кроликов, отличающийся тем, что очищенную трепонемную взвесь подвергают инактивации при температуре (55±3)^oС в течение (30±2) мин или нейтральным формалином в конечной концентрации (0,6±0,2)% в течение (84±12) ч, центрифугированию при 2500 g в течение (60±5) мин и обрабатывают ионным детергентом - SDS - в концентрации (1,5±0,5)% в течение (30±2) мин при температуре (60±2)^oС или неионным детергентом - тритоном Х-100 - в конечной концентрации (0,3±0,1)% в течение (30±2) мин при температуре (38±2)^oС, с последующим центрифугированием при 200 g в течение (60±5) мин.