ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВОЗБУДИТЕЛЮ СИФИЛИСА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/577 G01N33/571 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в производстве диагностических препаратов для выявления сифилиса на различных стадиях заболевания.

Иммуноферментный анализ (ИФА) широко используется в диагностике инфекционных заболеваний благодаря широкому спектру определяемых антител, антигенов или гаптенов, а также возможности автоматизации при чтении результатов и постановке реакции.

Специфичность и чувствительность ИФА обусловлены принципом его осуществления, при котором зафиксированный на твердом носителе антиген инкубируется с тестируемой сывороткой, затем с антивидовым глобулином, меченным ферментом. Взаимодействие фермента с субстратом дает цветную реакцию, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител.

Повышение чувствительности и специфичности ИФА достигается выбором твердого носителя с достаточно стойкими иммунологическими свойствами, чистотой и активностью антигенов и антител, выбором каталитически активных ферментов и хромогенных субстратов, оптимизацией условий реакции (Иммуноферментный анализ и его применение в инфекционной патологии. Обзорная информация под ред. В.И. Покровского, Е.П. Голубинского.- М.: ВНИИМИ, 1986).

Использование ИФА в диагностике сифилиса известно с 1975 г., однако достаточной специфичности и чувствительности в выявлении антител к возбудителю сифилиса, особенно на начальных стадиях и при латентных формах заболевания, пока не достигнуто.

Во многом это обусловлено свойствами трепонемных культур, используемых в качестве антигена. Высокий уровень числа отрицательных реакций при наличии заболевания и неспецифически-положительных реакций при наличии аутоиммунных заболеваний у пациентов связан с наличием липидов в бледных трепонемах.

Установлено, что специфическая антигенная активность трепонемы связана с протеином клетки и содержанием глютамина.

Известно использование ряда тестов на основе очищенных непатогенных трепонем и аффинно-очищенных антител, конъюгированных пероксидазой хрена. Однако результаты реакций при различных исследованиях трудно сопоставимы и неоднозначны на различных стадиях заболевания.

Более чувствительным является метод иммуноблотинга, при котором трепонемы подвергаются электрофорезу в градиенте концентрации додецилсульфата натрия. Затем проводится обработка разделенных белковых иммунодетерминант на нитроцеллюлозе исследуемой сывороткой и антителами к JgG либо JgM, меченными ферментами либо радиоактивными веществами. При этом иммунодетерминанты 15.5, 17, 44.5 и 47 кД являются диагностическими при сифилисе.

Однако эта тест-система практически трудно осуществима при массовых обследованиях и для организации ее промышленного производства (Г.А. Дмитриев, Е.Е. Брагина. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса//Венерология и дерматология, 1996, N 3, с. 33-34).

Наиболее близкой к заявляемой является промышленно выпускаемая тест-система иммуноферментная для серодиагностики сифилиса, разработанная Центральным кожно-венерологическим институтом (ЦКВИ) (Г.А. Дмитриев, Е.Е. Брагина. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса//Венерология и дерматология, 1996, N 3, с. 34).

В этой тест-системе в качестве антигена применяет взвесь обработанных ультразвуком непатогенных трепонем штамма Рейтер, для выявления комплекса антиген-антитело используют антивидовую сыворотку, меченную пероксидазой хрена.

Чувствительность и специфичность этой тест-системы значительно выше традиционной РСК, однако все же высок уровень ложноотрицательных и ложноположительных реакций, особенно на стадиях первичного обследования и латентном периоде заболевания, что обусловлено наличием во взвеси антигена не только протеинов клетки, а также мембранной цитоплазмической структуры, снижающей активность антигена.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности тест-системы и обеспечение возможности ее промышленного производства.

Поставленная цель достигается тем, что иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса включает фиксирование на твердофазном носителе антигена выделенной из ультраозвученной непатогенной трепонемы ее клеточной структуры, очищенной методом аффинной хроматографии, инкубирование антигена с тестируемой сывороткой и пероксидазным конъюгатом, который конструируется на основе моноклональных анти-JgM и анти-JgG, добавление субстрата и учет результатов реакции.

По отношению к прототипу заявляемая тест-система имеет следующие отличительные признаки.

Использование в качестве антигена клеточной структуры, выделенной из ультраозвученных непатогенных трепонем и очищенной методом аффинной хроматографии. Как известно, именно клеточная структура трепонем обладает необходимым составом гликопротеинов, которые являются наиболее специфическими иммунодетерминантами. Аффинная очистка способствует удалению липидных соединений, причем эти приемы технологически доступны и создают наиболее щадящие условия разрушения микроорганизмов. Использование этого признака обеспечивает повышение специфичности тест-системы. Способ получения указанной клеточной структуры, выделенной из ультраозвученной непатогенной трепанемы, описан в заявке на изобретение РФ, опубликованной 10.06.98 и зарегистрированной под N 96006615. Для очистки макромолекул от белковых соединений была использована классическая методика аффинной хроматографии. В принципе для этой цели можно использовать и другие известные методы, например гель-фильтрацию, адсорбционную хроматографию.

Конструирование пероксидазного конъюгата на основе моноклональных анти-JgM и анти-JgG. Моноклональные антитела имеют большие преимущества перед поликлональными антисыворотками, проявляющиеся в постоянстве воспроизводимости состава, в отсутствии перекрестной реактивности и способности прецитипировать антигены, в высокой концентрации специфических антител. Совместное использование гибридных молекул JgM и JgG на участке соединения антиген-антитело создает оптимальные условия реакции, так как JgM способствует проколу бактериальной стенки быстрее и эффективнее, чем JgG, который имеет способность вызывать фиксацию комплемента. Предлагаемый состав конъюгата обеспечивает чувствительность и специфичность реакции.

Возможность практического использования заявляемой тест-системы иллюстрируется примером конкретного выполнения с использованием полной совокупности признаков изобретения.

Пример. Суспензию 3-недельной бактериальной культуры непатогенного штамма Treponema Pallidum, выращенную на плотной питательной среде, подвергают баллистической дезинтеграции, дезинтеграт центрифугируют и их надосадочной жидкости центрифугированием выделяет в осадок клеточные стенки культуры, которые промывают физраствором и очищают методом аффинной хроматографии. Полученный антиген разводят в 0,1 M карбонат-бикарбонатном буфере с pH 9.5 до концентрации 10 мкг/мл, заливают в полистироловые 96-луночные планшеты на 2 ч при 37^oC. Затем антиген трехкратно промывают водопроводной водой и 0.05%-ным раствором твина-20.

В сенсибилизированные антигеном лунки планшета вносят в дублях по 200 мкл тестируемой сыворотки, при этом в 8 лунок вносят в дублях по 200 мкл промывающего раствора (раствор твина-20 в 0.85%-ном растворе NaCl), контрольной сыворотки человека, положительной (++++), содержащей антитела к антигенам трепонем, контрольной сыворотки человека слабоположительной (++) и контрольной сыворотки человека отрицательной (-), не содержащей антител к антигенам трепонем. Все сыворотки разводят водным раствором пептона - 0.04 г/мл.

Планшет выдерживают в термостате при 37^oC в течение 30 мин. Затем вытряхивают жидкость из лунок, промывают их промывающим раствором и во все лунки добавляет по 200 мкл раствора конъюгата, за исключением лунок с промывающим раствором в том же количестве.

Раствор конъюгата готовят растворением в промывающем растворе 1:100 моноклональных антител JgM, JgG, меченных пероксидазой из хрена, 1%-ного бычьего сывороточного альбумина и мертиолят в концентрации 10^-4.

Планшет выдерживают в термостате при 37^oC в течение 30 мин. Удаляют жидкость из лунок и промывают их промывающим раствором. В каждую лунку планшета вносят по 200 мл субстратной смеси.

Субстратную смесь готовят смешиванием 0.8%-ного водного раствора 5-аминосалициловой кислоты с раствором гидроокиси натрия до pH 6 и добавлением 0.05%-ного раствора перекиси водорода 1:0.01.

Планшет выдерживает 1 ч при комнатной температуре в темном месте.

Учет результатов реакции проводят визуально:
- в лунках без сывороток cубстратная смесь не должна изменять окраску, быть бесцветной или светло-бежевой (-);
- в лунках с контрольной сывороткой человека отрицательной окраска субстратной смеси светло-бежевая или темно-бежевая (-);
- в лунках со слабоположительной контрольной сывороткой субстратная смесь окрашивается в светло-коричневый цвет (++);
- в лунках с положительной контрольной сывороткой субстратная смесь окрашивается в коричневый, темно-коричневый цвет (++++).

Тест-система считается специфически активной при наличии выраженной реакции с положительными контрольными сыворотками и отсутствием реакции с отрицательной контрольной сывороткой.

Заявляемая тест-система была испытана на 604 сыворотках, в том числе 300 - от больных с подтвержденным диагнозом сифилиса, из них у четырех больных отрицательный результат теста; 150 - от больных различными кожными заболеваниями, из них у трех больных ложноположительный результат теста; 154 - от здоровых лиц, из них у двух ложноположительный результат.

Чувствительность заявляемой тест-системы составляет не менее 97%, специфичность 98%.

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в производстве диагностических препаратов для выявления сифилиса. Тест-система включает в себя фиксированный на твердофазном носителе антиген - выделенную из ультраозвученной непатогенной трепонемы клеточную структуру и пероксидазный конъюгат. Тест-система используется при инкубации антигена с тестируемой сывороткой с последующим добавлением субстрата и учетом результатов реакции. Пероксидазный конъюгат конструируется на основе моноклональных анти-JgM и анти-JgG. Тест-система обладает повышенной чувствительностью и специфичностью и может производиться в промышленном масштабе.

Иммуноферментная тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса, содержащая фиксированный на твердом носителе антиген - обработанные ультразвуком клетки непатогенной трепанемы и пероксидазный конъюгат и используемая при инкубировании с тестируемой сывороткой с последующим добавлением субстрата и учетом результатов реакции, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит выделенные клеточные структуры ультраозвученной непатогенной трепанемы, а в качестве пероксидазного конъюгата - конъюгат на основе моноклональных анти-JgM и анти-JgG.