СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ КАРТОФЕЛЯ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К РИЗОКТОНИОЗУ Российский патент 2003 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства и может быть использовано для получения форм картофеля, устойчивых к ризоктониозу.

Ризоктониоз известен во всех странах, где занимаются возделыванием картофеля. Это заболевание распространено в США, странах западной Европы. Ризоктониоз широко распространен и вредоносен во всех трех зонах картофелеводства Сибири и Дальнего Востока.

Первые признаки этой болезни проявляются на всходах - коричнево-ржавые пятна, которые охватывают подземную часть стебля. Такие побеги со временем отмирают. К концу вегетации гриб образует половую стадию - грязновато-белый налет у основания стебля "белую ножку". Образующиеся базидиоспоры заражают клубни картофеля нового урожая. Потери урожая от этого заболевания ежегодно составляют 17-30%, достигая в отдельные годы до 45%.

Многообразие форм проявления ризоктониоза обуславливает высокую вредоносность данного заболевания. Поэтому очень остро стоит вопрос о получении сортов картофеля, устойчивых к этому заболеванию. А в настоящее время еще не имеется сведений о получении абсолютно устойчивых сортов к ризоктониозу.

Известен способ селекции картофеля на устойчивость к патогену, включающий культивирование каллусной ткани на селективной питательной среде с токсином Coryne bacterium sepedonicum. В результате были получены каллусные линии двух сортов картофеля, некоторые из которых дали регенеранты, устойчивые к патогену (Хромова Л.М., Седнина Г.В. и др. Клеточная селекция картофеля. Сельхозбиология, 1983, 6).

Недостатками известного способа являются низкая эффективность и высокая трудоемкость.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ селекции картофеля на устойчивость к фитофторе, включающий облучение каллусной культуры гамма-излучением в дозе 2000 рентген, культивирование последней на селективной питательной среде, содержащей токсичную концентрацию Phytophtora infestans, высаживание отселектированных растений в грунт и последующий отбор растений, устойчивых к патогену. В результате было получено 34 растения картофеля при регенерации от 10 различных каллусов, отселектированных на устойчивость к культуральному фильтрату Phytophtora infestans и 15 контрольных растений от неселектированных каллусов.

Недостатками известного способа являются длительность, трудоемкость и ограниченность в выборе материала для селекции.

Технической задачей изобретения является повышение эффективности способа за счет уменьшения его трудоемкости и времени, требуемого для получения устойчивых к ризоктониозу форм картофеля.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Исходные растения картофеля, выращенные in vitro, облучают гамма-излучением в дозе 1500-3000 рентген. Облученные растения разрезают на черенки с единичной пазушной почкой и высаживают на селективную питательную среду, состоящую из среды Мурасига-Скуга и культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani, выращенного на среде Richardsa в течение 14 дней. При этом отбор проводят двукратный на двух штаммах Rhizoctonia solani, принадлежащих к одной анастамозной группе Ag-3 и отличающихся по фитотоксичности. Причем сначала черенки помещают на среду, содержащую культуральный фильтрат менее токсичного штамма ( 1) с концентрацией 40-50%, выжившие побеги микроклонально размножают на среде Мурасига-Скуга и высаживают на селективную среду, содержащую более фитотоксичный штамм ( 2). Для более жесткого отбора на среде со штаммом 2 используют 80-100% концентрацию культурального фильтрата.

Выжившие на второй селективной среде почки снова микроклонально размножают и растения высаживают в вазоны с грунтом, искусственно зараженным инокулюмом двух штаммов R.solani. Через 3 месяца вегетации проводят учет пораженности подземных органов растений картофеля ризоктониозом по шкале Franka:
0 баллов - нет поражений;
1 балл - одно поражение <25 мм;
2 балла - одно поражение длиной 26-50 мм или несколько мелких поражений длиной <50 мм;
3 балла - одно или несколько поражений более 50 мм, но не окольцовывающих стебель;
4 балла - одно или несколько поражений;
5 баллов - одно или несколько поражений >25 мм, окольцовывающих менее 25 мм, окольцовывающих стебель; стебель.

Индекс развития болезни определяют по формуле
R=[Σ(а•в)]/(N•К•100%),
где а - количество пораженных стеблей;
в - соответствующий балл поражения;
N - количество учтенных растений;
К - высший балл шкалы.

Растения, имеющие нулевой индекс развития болезни, считают устойчивыми к ризоктониозу. Такие растения отбирают и используют как исходный материал картофеля, устойчивый к ризоктониозу для улучшения сорта.

Отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются:
1. В качестве исходных форм картофеля используют интактные растения, выращенные in vitro, а не каллусную культуру, что позволяет упростить способ и снизить трудоемкость, связанную с получением регенерантов.

2. Исходные формы картофеля подвергают облучению гамма-излучением в дозе 1500-3000 рентген, что позволяет получить большее количество мутантных форм и выделить более устойчивые к ризоктониозу формы, чем среди необлученных.

3. Черенки облученных растений выращивают последовательно, сначала на селективной питательной среде, содержащей 40-50% культурального фильтрата R. solani AG 3 штамма 1, а выжившие растения подвергают отбору на второй селективной среде, содержащей 80-100% культурального фильтрата более фитотоксичного штамма 2, что позволяет повысить эффективность способа в получении более устойчивых форм.

4. Отселектированные таким образом растения высаживают в грунт, зараженный инокулюмом этих же штаммов, что позволяет оценить степень их устойчивости к ризоктониозу и повысить надежность отбора. При этом концентрация патогенов в грунте составляет 12-14 пропагул на 100 г почвы, что соответствует естественному фону этого возбудителя в природе.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Селекция форм картофеля на устойчивость к ризоктониозу была проведена на 6 сортах картофеля: Адретта, Роза Сибири, Русте, Санте, Снегирь и Ранний Желтый в лабораторных и тепличных условиях Института цитологии и генетики СО РАН.

Исходные растения картофеля (7-10 пробирок каждого сорта), выращенные в условиях in vitro, были облучены дозой 3000 рентген. Облученные растения были разрезаны на черенки с единичными пазушными почками и высажены по 5-10 штук в стаканчики на селективную среду, состоящую из среды Мурасига-Скуга с добавлением 40-50% культурального фильтрата R.solani AG-3 штамма 1, выращенного на среде Ричардса в течение 14 дней. Выжившие почки отсаживали на среду Мурасига-Скуга, где их размножали. Выросшие растения снова черенковали таким же образом, как и в первом случае и затем высаживали на вторую селективную среду, содержащую 80-100% культурального фильтрата R.solani AG-3 штамма 2, обладающего большей фитотоксичностью, чем штамм 1. Выжившие почки отсаживали для микроклонального размножения на среду Мурасига-Скуга, а затем высадили в теплице в вазонах с почвой, искусственно зараженной инокулюмом этих же двух штаммов R.solani AG-3.

После 3-х месяцев вегетации провели оценку данного материала на устойчивость к ризоктониозу. В таблице 1 приведены данные по влиянию отбора на культуральном фильтрате R.solani на устойчивость к ризоктониозу.

Из данных таблицы 1 видно, что проведенный двухкратный отбор в очень жестких условиях второго отбора на 100% культуральном фильтрате штамма 2 дает возможность отобрать растения с нулевым индексом развития болезни. Так, растения сорта Санте, при однократном отборе на первой селективной среде с 40% концентрацией культурального фильтрата имели индекс развития болезни 20%, а прошедшие двукратный отбор имели нулевой индекс развития болезни. Растения сорта Адретта менее устойчивы к ризоктониозу. Так, в контроле, растения сорта Санте имели 40% индекс развития болезни, а у Адретты - 80% и растения после однократного отбора имели индекс 60%, но после двукратного отбора растения имели нулевой индекс.

В таблице 2 представлены данные по влиянию генотипа сорта картофеля на результаты отбора на культуральном фильтрате R.solani.

Из таблицы 2 видно, что исследуемые сорта имеют разную устойчивость к ризоктониозу. Так, сорта Роза Сибири, Ранний желтый и Русте более устойчивы, чем Снегирь и Адретта. Но на всех сортах, даже после однократного отбора, удалось получить растения, более устойчивые к ризоктониозу. Так, у сортов Роза Сибири и Ранний желтый получили растения с нулевым индексом развития болезни, а у неустойчивых сортов (сорт Снегирь) получены растения с 20% индексом развития болезни по сравнению с 60% в контроле; у Адретты с 30% по сравнению с 80% индексом развития болезни в контроле.

В результате были получены следующие устойчивые формы. Из сорта Санте было выделено 2 полностью устойчивые формы. Из сорта Роза Сибири 1 форма. Из сорта Ранний желтый - 1. Из сорта Адретта - 1. Из сортов Снегирь и Русте полностью устойчивых форм выделить не удалось, но отобранные из них формы показали большую устойчивость по сравнению с исходным сортом. Отобранные формы картофеля использовали в дальнейшей селекционной роботе как исходный материал, для получения устойчивых к ризоктониозу сортов. Используя экспериментально подобранные оптимальные условия двухстадийного отбора на селективной питательной среде, содержащей культуральные фильтраты вышеназванных штаммов в определенных концентрациях, можно за короткое время получить устойчивые к ризоктониозу формы картофеля. Весь технологический процесс может занять следующее время: 14 дней на получение культурального фильтрата на среде Ричардса, затем 7 дней на селективной среде с метаболитами 1-го штамма, размножение отобранных растений 3-5 недель, затем 7 дней на селективной среде с метаболитами 2-го штамма, затем размножение до нужного количества (3-7 недель), высадка в грунт или в теплицу на инфекционный фон и окончательная оценка и отбор устойчивых форм растений (3 месяца). То есть весь процесс может занять от 22 до 28 недель (5,5-7 месяцев). Способ прост в исполнении, не требует получения регенерантов.

Источники информации
Прототип: BEHNKE M. Selection of potato callus for resistantce to culture filtrates of phitophtora infestance and regenerations of resistant plants. Theor. and Appl., 1979, v.55, p.69-71.

Изобретение предназначено для использования в области сельского хозяйства. Способ включает облучение исходного материала гамма-излучением в дозе 1500-3000 ренген. Культивирование материала проводят на селективной питательной среде, содержащей токсичную концентрацию культурального фильтрата патогена. Высаживают в грунт отселектированные на устойчивость растения и проводят последующий отбор растений, устойчивых к патогену. При этом в качестве исходного материала используют интактные растения, выращенные in vitro. Культивирование черенков проводят сначала на среде, содержащей 40-50% культурального фильтрата штамма Rhizoctonia solani AG 3 1, а затем на среде, содержащей 80-100% культурального фильтрата штамма Rhizoctonia solani AG 3 2. Отселектированные растения высаживают в грунт, зараженный двумя этими же штаммами по 6-7 пропагул каждого из штаммов на 100 г почвы. Изобретение позволяет снизить трудоемкость, а также время на получение устойчивых форм картофеля. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Способ селекции картофеля на устойчивость к ризоктониозу, включающий облучение исходного материала гамма-излучением, культивирование материала на селективной питательной среде, содержащей токсичную концентрацию культурального фильтрата патогена, высаживание в грунт отселектированных на устойчивость растений и последующий отбор растений, устойчивых к патогену, отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют интактные растения, выращенные in vitro, культивирование черенков проводят сначала на среде, содержащей 40-50% культурального фильтрата штамма Rhizoctonia solani AG 3 № 1, а затем на среде, содержащей 80-100% культурального фильтрата штамма Rhizoctonia solani AG 3 № 2, а отселектированные растения высаживают в грунт, зараженный двумя этими же штаммами.