СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики функционального состояния нейтрофилов человека путем исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов.

Кислородзависимый метаболизм нейтрофильных гранулоцитов (НГ) является уникальной системой немитохондриального дыхания, которое резко возрастает в процессе клеточной активации - так называемый "респираторный взрыв". Это событие сопровождается повышенным потреблением глюкозы и кислорода, а также увеличением продукции активных форм кислорода (супероксид анион, пероксид водорода, гидроксил радикал и синглетный кислород) [4]. Кислородные радикалы являются не только основой антимикробного потенциала нейтрофилов, но и активными регуляторами тканевого метаболизма человека [1]. Таким образом, исследование кислородзависимого метаболизма НГ позволит судить о функциональном состоянии ключевой клетки системы антимикробной резистентности организма, реагирующей на любые изменения гомеостаза. Показана высокая информационно-диагностическая значимость исследования функциональной активности нейтрофилов при бактериальных и вирусных инфекциях, коллагенозах, травмах, сердечно-сосудистых и стоматологических заболеваниях [11, 16, 18].

Одним из основных методов исследования кислородзависимого метаболизма НГ является тест с нитросиним тетразолием (НСТ), который основан на способности практически бесцветного НСТ восстанавливаться кислородными радикалами в темно-синий диформазан (ДФ). Наибольшее распространение получили варианты визуального учета НСТ-теста, основанные на микроскопическом подсчете НГ, содержащих в цитоплазме ДФ [2, 6, 14, 20, 22].

Основными недостатками такого подхода являются отсутствие количественной регистрации кислородных радикалов, генерированных пулом нейтрофилов, и субъективность учета результатов реакции. С целью устранения указанных недостатков предложены варианты фотометрического учета НСТ-указанных недостатков предложены варианты фотометрического учета НСТ-теста. Оптическое измерение экстрагированного ДФ позволяет количественно оценивать интенсивность реакции и, соответственно, объективней оценивать функциональную активность клеток. В свою очередь, эти методики подразделяются по способу экстрагирования восстановленного НСТ и регистрации оптической плотности полученного раствора. Большинство авторов для решения этих задач используют кипячение прореагировавших клеток на водяной бане в присутствии органических растворителей (диоксана, пиридина, диметилформамида) с последующей фотометрией надосадочной жидкости в кюветных спектрофотометрах [3, 9, 12, 13, 23].

Однако использование больших объемов реагентов, использование кипящих токсических растворителей и отсутствие автоматизированной регистрации результатов реакции существенно ограничивает производительность и повышает трудоемкость данных модификаций.

Известен способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека путем автоматизированного учета НСТ-теста с использованием пластиковых планшетов и многоканального спектрофотометра [8]. Известный способ проводится с выделенными нейтрофилами крови, которые получают после центрифугирования на градиенте фиколла - верографина (d=1,077 г/см³) и лизиса примеси эритроцитов хлористым аммонием. Полученную клеточную суспензию доводят до концентрации 1•10⁶ клеток/мл. Клетки инкубируют 30 мин при 37^oС в присутствии раствора НСТ (4 мг/мл), забуференного физиологического раствора (спонтанный вариант) или определенного разведения индуктора (продигиозан или опсонизированный комплементом морской свинки зимозан) - индуцированный вариант. Образовавшийся внутриклеточно ДФ экстагируют смесью 2М КОН и диметилсульфоксида при температуре 56^oС в течение 10-15 минут. Спектроскопию проводят при длине волны 620 нм и результаты реакции выражают в единицах оптической плотности (ед. О.П.).

Недостатком способа является слабая активация нейтрофилов и отсутствие дозозависимости в ответ на индукцию продигиозаном в концентрации 3,2, 6,3 и 12,5 мкг/мл. Кроме того, к недостаткам данного способа можно отнести длительность этапа выделения НГ, применение одноволнового принципа регистрации и отсутствие контроля специфичности реакции.

Техническим результатом заявленного способа является оптимизация метода фотометрического учета результатов НСТ-теста с нейтрофилами человека.

Это достигается тем, что в способе диагностики функционального состояния нейтрофилов человека путем исследования кислородзависимого метаболизма, заключающемся в предварительном выделении нейтрофильных гранулоцитов, постановке реакции восстановления нитросинего тетразолия в 96-луночных плоскодонных планшетах для иммунологических исследований и последующей фиксации результатов реакции с помощью многоканального фотометра, при этом в процессе выделения нейтрофильных гранулоцитов человека из венозной крови человека проводят центрифугирование в двойном градиенте плотности фиколл-верографина 1,118 и 1,076 г/мл, осуществляют гипотонический лизис примеси эритроцитов, доводят гранулоциты до концентрации 5•10⁶ кл/мл и оценивают их функциональное состояние по уровням спонтанной и индуцированной активности, причем для определения уровня спонтанной активности в лунку вносят 50 мкл 0,4% раствора нитросинего тетразолия, 50 мкл инкубационной среды и 100 мкл клеточной суспензии, а для определения уровня индуцированной активности в лунку вносят 50 мкл 0,4% раствора нитросинего тетразолия, 50 мкл взвеси стимулятора и 100 мкл клеточной суспензии, каждый вариант реакции проводят в 2-х параллельных пробах, контроль реагентов осуществляют заменой клеточной суспензии эквивалентным объемом инкубационной среды, после внесения всех реагентов планшет с пробами инкубируют 20 минут при 37^oС, для остановки реакции восстановления нитросинего тетразолия и осаждения клеток, содержащих темносиний диформазан, планшет центрифугируют 10 мин при 450-550 g, затем для фиксации осажденных клеток отделяют надосадок, добавляют 200 мкл этанола и центрифугируют раствор 5 мин при 450-550 g, для отмывания фиксированных клеток отделяют надосадок, добавляют 200 мкл 0,85% раствора NaCl и центрифугируют в том же режиме, для растворения образовавшегося диформазана в каждую пробу добавляют 130 мкл димексида и инкубируют при 58^o-63^oС 20 мин, после чего добавляют 70 мкл раствора КОН, и для равномерного окрашивания раствора осуществляют пипетирование, результаты реакции регистрируют на фотометре по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм, оценку результатов проводят по спонтанному и индуцированному уровням активности нейтрофилов, выраженным в единицах оптической плотности, причем в качестве индукторов используют опсонизированный зимозан и неопсонизированный зимозан, для каждого из которых определяют коэффициент активации как отношение индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню активности, а по отношению индуцированного опсонизированным зимозаном уровня активности к индуцированному неопсонизированным зимозаном уровню определяют коэффициент опсонизации.

Проведено 40 серий исследований, посвященных подбору концентрации нейтрофилов в анализируемом образце (20 серий), концентрации используемых индукторов (10 серий), определению спектра поглощения для раствора ДФ (10 серий). Исследовали венозную гепаринизированную (15 ЕД/мл) кровь 28 первичных доноров крови и 99 больных: 24 пациента с распространенным перитонитом, 25 - с термической травмой 15-30% поверхности тела в стадии септикотоксемии, 34 - с медиальными переломами шейки бедренной кости (ШБК) в течение первых 3-х суток с момента травмы, 16 - с отравлениями психотропными препаратами (ПСП).

Образцы крови подвергали градиентному центрифугированию, используя фиколл-верографин плотностью 1,118 г/мл и 1,076 г/мл ("Pharmacia", Швеция, СПОФА, Словакия). В полученной клеточной суспензии эритроциты лизировали добавлением дистиллированной воды с последующим восстановлением изотоничности раствора. Чистота выделения нейтрофилов составляла 95-97%, жизнеспособность, исследуемая в тесте с 1%-ным раствором трипанового синего - 97-98%.

Оценку кислородзависимого метаболизма НГ проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для иммунологических исследований ("Медполимер", Россия). Использовали следующие реагенты: 0,85% раствор NaCl, 0,4% раствор нитросинего тетразолия ("Sigma", США), неопсонизированный зимозан (н/оЗМ) (НПО "Биохимреактив", Олайне) и зимозан, опсонизированный сывороткой человека (опсЗМ), приготовленный по методу [7], нативную сыворотку крови крупного рогатого скота (МК "Омский", Россия), 96%-ный раствор этилового спирта, димексид ("Адамантан", Россия), 2М раствор КОН ("Merck", Германия). В работе использовали оборудование: автоматические дозаторы с регулируемым объемом от 5 до 5000 мкл ("Labsystems", Финляндия), центрифугу РС-6 (Россия) с изготовленным нами приспособлением для центрифугирования планшетов, микроскоп Бимам Р-13 ("ЛОМО", Россия), термостат ТС-80М (Россия), фотометр Dinatech MR 7000 (Германия), снабженный светофильтрами для регистрации оптической плотности на следующих длинах волн: 410, 450, 490, 570 и 630 нм.

Оптимизация метода фотометрического учета результатов НСТ-теста с нейтрофилами человека осуществлялась по нескольким направлениям:
I. Анализ влияния количества нейтрофилов в лунке планшета на количество образовавшегося ДФ. Оптимальным следует считать количество НГ в пределах от 250 до 750 тысяч в лунке. В данном диапазоне оптическая плотность раствора в спонтанном тесте линейно нарастает с 0,18 до 0,35; в индуцированном - с 0,65 до 1,25. Из этой зоны оптимума нами выбрана концентрация в 500±50 тысяч нейтрофилов на лунку. Использование большей концентрации клеток является нерациональным, а снижение количества приводит к росту погрешности метода.

II. Для оптимизации индуцированного НСТ-теста исследовали влияние концентрации индукторов на оптическую плотность раствора ДФ. Линейное увеличение плотности выявлено при содержании н/оЗМ и опсЗМ от 10 до 30 частиц на клетку. Дальнейшее увеличение концентрации приводит к нелинейному изменению оптической плотности, что позволило считать оптимальным указанный диапазон. Нами выбрана концентрация: 15±3 частиц на клетку.

III. Конечный продукт НСТ-теста в лунке имеет бирюзовое окрашивание, интенсивность которого зависит от количества образовавшегося ДФ. Чтобы уменьшить ошибки, вызванные присутствием в растворе посторонних окрашенных веществ или его мутностью, рекомендуется использование двух- или трехволнового метода измерения [10] . С этой целью исследовали зависимость величины светопоглощения раствора ДФ от применяемой длины волны. Максимум поглощения выявлен на длине волны - 630 нм. Учитывая высокий уровень неспецифического поглощения, предложено оценивать концентрацию ДФ по разнице оптической плотности раствора, полученной вычитанием экстинкции при длине волны 490 нм, из экстинкции при длине волны 630 нм. Таким образом, полученные экспериментальные данные послужили основанием для использования следующих условий проведения фотометрического варианта НСТ-теста:
- использование концентрации НГ в лунке планшета 500±50 тыс. клеток;
- использование корпускулярных индукторов в концентрации 15±3 частиц на клетку;
- применение тестовой (?=630 нм) и референтной (?=490 нм) длин волн.

Соблюдение указанных принципов позволило достичь высокой воспроизводимости (коэффициент вариации 10-15%) и чувствительности (50 тыс. клеток) метода.

Способ осуществляют следующим образом.

Приводим описание методики проведения количественного метода исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов человека.

I. На первом этапе осуществляют выделение нейтрофильных лейкоцитов (продолжительность этапа 50-60 мин для 10 образцов).

Для чего на двойной градиент плотности (1,118 г/мл и 1,076 г/мл) фиколл-верографина (объемом по 2 мл каждый) наслаивают 8 мл крови, приготовленной следующим образом: 3 мл исследуемой крови разводят в 5 мл 0,85%-ного раствора NaCl. Центрифугируют 15 мин при 250 g. Забор нейтрофилов производят с помощью капилляра на границе раздела плазма/эритроциты. К отобранным в пластиковую пробирку клеткам добавляют 10-кратный объем 0,85%-ного раствора NaCl и центрифугируют 10 мин при 250 g. Добавляют к клеточному осадку 10 мл дистиллированной воды и щадяще ресуспендируют 30-40 сек. Затем добавляют 1 мл 8,5%-ного раствора NaCl и центрифугируют 10 мин при 250 g. Выделенные НГ доводят до концентрации 5•10⁶ кл/мл, помещая клетки в инкубационную среду (ИС) - 0,85%-ный раствор NaCl с 20%-ным содержанием сыворотки крупного рогатого скота.

II. Второй этап характеризует постановку НСТ-теста, его продолжительность - 2 часа.

Функциональное состояние нейтрофилов оценивают по уровням спонтанной и индуцированной активности НГ.

Для исследования спонтанной активности в каждую лунку внесят: 50 мкл раствора НСТ, 50 мкл ИС и 100 мкл суспензии нейтрофилов. Для исследования индуцированной активности в каждую лунку внести: 50 мкл раствора НСТ, 50 мкл взвеси стимулятора и 100 мкл клеточной суспензии (каждый вариант реакции проводить в 2-х параллельных пробах).

С целью контроля над специфичностью получаемых результатов в каждом варианте реакции клеточную суспензию заменяют эквивалентным объемом ИС. После внесения всех реагентов планшет инкубируют при 37^oС 20 мин.

Для остановки реакции и осаждения клеток, содержащих ДФ, пробы центрифугируют 10 мин при 500 g. Для фиксации осажденных клеток отделяют надосадок, добавляют 200 мкл этанола и центрифугируют 5 мин при 500 g. Для отмывания фиксированных клеток отделяют надосадок, добавляют 200 мкл 0,85%-ного раствора NaCl и центрифугируют в том же режиме.

Для растворения образовавшегося ДФ добавлят в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60^oС 20 мин. После инкубации добавляют 70 мкл раствора КОН и тщательным пипетированием добиваются равномерного окрашивания раствора. Результаты реакции фиксируют на фотометре по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм и учитывают в mOD (OD от англ. Optical Density - оптическая плотность).

III. На третьем этапе оценку результатов СФВ НСТ-теста проводят по:
1. Спонтанному уровню активности нейтрофилов (сНСТ), выраженному в mOD.

2. Индуцированному опсонизированным зимозаном уровню активности нейтрофилов (о/зНСТ), выраженному в mOD.

3. Индуцированному неопсонизированным зимозаном уровню активности нейтрофилов (н/зНСТ), выраженному в mOD.

4. Коэффициентам активации - расчетным величинам, определяемым по отношению: о/зНСТ к сНСТ - КАо; н/зНСТ к сНСТ - КАн.

5. Коэффициенту опсонизации, определяемому по отношению о/зНСТ к н/зНСТ-КО.

С помощью оптимизированного фотометрического варианта НСТ-теста оценивают кислородзависимый метаболизм нейтрофилов у пациентов указанных групп. С целью объективизации исследования параллельно проводят спонтанный и активированный латексом НСТ-тест (спНСТ и латНСТ (соответственно)) в его микроскопической модификации [2]. Полученные данные после статистической обработки с помощью программы "Биостатистика" [5] представлены в таблице.

Представленный в таблице материал наглядно демонстрирует схожий характер изменения спонтанной активности нейтрофилов на фоне обширного гнойно-воспалительного процесса - перитонит, ожоговая травма. Так, с помощью фотометрического варианта НСТ-теста выявлено достоверное увеличение продукции кислородных метаболитов на 80 и 65% соответственно. Аналогичная, но выраженная в меньшей степени (32 и 23%) тенденция отмечена по данным микроскопического варианта. Подавление уровня спонтанной клеточной активности зафиксировано у пациентов с медиальными переломами бедра и в особенности у больных с экзогенным отравлением ПСП. Продукция кислородных радикалов пулом нейтрофилов была достоверно снижена на 60%, а процент ДФ позитивных клеток - на 23%.

Угнетение кислородзависимого метаболизма НГ в ответ на дополнительную стимуляцию опсЗМ, н/оЗМ и латексом у больных с отравлением ПСП было значимо снижено на 72, 80,5, и 22% соответственно. Достоверное подавление индуцированных тестов у пациентов с переломами ШБК отмечено только в фотометрическом варианте НСТ-теста при использовании не- и опсонизированного зимозана (36 и 40% соответственно). У ожоговых больных и пациентов с распространенным перитонитом имелась тенденция к снижению процента активированных латексом НГ. Напротив, лейкоциты пациентов данных групп в ответ на стимуляцию зимозаном отвечали достоверным повышением продукции активных форм кислорода. Значения о/зНСТ-теста у пациентов с термической травмой были повышены на 35%, н/оНСТ-теста - на 40%. У больных с перитонитом происходило "расщепление" функциональной активности клеток: увеличение лейкоцитарной активности в тесте с н/оЗМ наблюдалось на фоне практически неизменного ответа на опсЗМ. По всей видимости, такая клеточная реакция (в первую очередь) зависит от рецепторной перестройки НГ, возникающей в силу целого ряда причин:
Во-первых, выраженная воспалительная реакция сопровождается выбросом из костномозгового депо большого количества юных форм нейтрофилов, обладающих незрелым рецепторным аппаратом.

Во-вторых, в связи с процессами интернализации и/или "шеддинга" рецепторов к Fc фрагментам иммуноглобулинов класса G (в частности, FcrRII, FcrRIII), происходящими при активации НГ [15, 19, 21].

В-третьих, имеются данные об опосредуемой через интегрины (осуществляют рецепцию н/оЗМ) негативной регуляции кислородзависимого метаболизма нейтрофилов в ответ на стимуляцию опсЗМ. В основе этого феномена, по-видимому, лежит вовлечение конкурентных путей клеточной активации, использующих общие вторичные мессенджеры (тирозин и фосфатидилинозитолкиназы) [24].

Таким образом, способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека за счет использование не- и опсонизированного зимозана позволяет выявлять случаи функциональной дискретности нейтрофилов в ответ на стимуляцию, опосредованную через различные рецепторные структуры и пути активации. Так, в группе больных с медиальными переломами бедра в 47% наблюдений отмечали подавление метаболической активности нейтрофилов в обоих индуцированных тестах, селективное подавление активации на опсЗМ в 23% случаев и лишь 29% пациентов имели нормальный ответ на оба стимула.

С целью описания прикладной значимости метода приведем клинический пример:
Больная Б. , 83-х лет поступила в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского через 2-е суток после травмы в быту. Клинический диагноз: субкапитальный перелом шейки левой бедренной кости со смещением. Гипертоническая болезнь II ст. Атеросклероз сосудов головного мозга, хроническая цереброваскулярная недостаточность.

При осмотре: область левого тазобедренного сустава увеличена в объеме, левая нижняя конечность ротирована кнаружи и укорочена на 2 см, пальпаторно область сустава резко болезненна, активные движения в левом тазобедренном суставе резко ограничены. На рентгенограмме - субкапитальный перелом шейки левого бедра со смещением.

Лабораторно: клинический анализ крови - Нb - 127 г/л, Эр - 4,0 млн., Лей - 5,5 тыс. , п/я - 2, с/я - 60, Э - 1, Лф - 31, М - 6; при исследовании кислородзависимого метаболизма НГ с помощью фотометрического и микроскопического вариантов НСТ-теста отмечено повышение показателей спонтанного уровня активности, подавление ответа на латекс и опсЗМ, сохранение ответа на н/оЗМ.

Наличие субкапитального перелома шейки левого бедра явилось показанием к эндопротезированию левого тазобедренного сустава. На 6-е сутки с момента поступления больной под эндотрахеальным наркозом произведено субтотальное эндопротезирование левого тазобедренного сустава биполярным эндопротезом фирмы "Beznoska" с цементной фиксацией бедренного компонента. Рана дренирована однопросветным силиконовым дренажем с вакуумной аспирацией в сборник типа "гармошка".

Лабораторные данные к моменту оперативного вмешательства: клинический анализ крови - Hb - 95 г/л, Эр - 3,2 млн., Лей - 9,0 тыс., п/я - 11, с/я - 76, Э - 0, Лф - 10, М - 3; значения микроскопического варианта НСТ-теста в пределах физиологической нормы, по данным фотометрического варианта - сохранение подавленного ответа на опсЗМ. Полученные данные послужили основанием для включения в комплекс лечебных мероприятий иммунокорригирующей терапии (полиоксидоний по 6 мг в/м 1 раз/сут в течение 5 дней). Лабораторный контроль эффективности комплексной терапии на 9-е сутки: клинический анализ крови - Hb - 95 г/л, Эр - 3,0 млн., Лей - 5,3 тыс., п/я - 4, с/я - 47, Э - 7, Лф - 36, М - 6; значения НСТ-тестов в пределах физиологической нормы.

Раневой процесс протекал гладко, послеоперационная рана зажила первичным натяжением, швы сняты на 11-е сутки. В удовлетворительном состоянии больная выписана домой на 14-е сутки с момента операции. Ближайшие результаты лечения и функции сустава хорошие.

Заявленный способ отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики иммунодефицитных состояний, обладает высокой чувствительностью и информативностью при воспалительных заболеваниях брюшной полости, ожоговой болезни, экзогенных отравлениях и травмах опорно-двигательного аппарата.

С помощью заявленного способа можно выявлять нарушения функциональной активности нейтрофилов человека с учетом дискретности механизмов их развития, проводить целенаправленную иммунокоррекцию и осуществлять контроль эффективности проводимой терапии.

Список литературы
1. Бахов Н.И., Александрова Л.З., Титов В.Н.//Лаб. дело. - 1988. - 6. - С.3 - 12.

2. Бумагина Т.К., Шмелев Е.И. //Лаб. дело. - 1981. - 4. - С. 200-202.

3. Вагнер В. К., Насонкин О.С., Борискина Н.Д. // Лаб. дело. - 1989. - 12. - С. 31-33.

4. Воспаление: Руководство для врачей. / Под ред. В.В. Серова, B.C. Паукова. - М., 1995.

5. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М., 1999.

6. Дранник Г.Н., Ковалев О.В. //Лаб. дело. - 1985. - 10. - С. 617-19.

7. Земсков В.М., Барсуков А.А., Безносенко С.А. и др. // Метод, рекомендации. - М., 1988.

8. Киселева Е.П., Полевщиков А.В. // Клин. лаб. диагн. - 1994. - 4. - С. 27-29.

9. Кубась В.Г., Данилова О.П., Никифорова Н.А. //ЖМЭИ. - 1987. - 4. - С. 58-59.

10. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В. В. Меньшикова. - М., 1987.

11. Маянский А.Н., Пикуза Щ.И. Клинические аспекты фагоцитоза. - Казань, 1993.

12. Невмятуллин А.Л., Зеленова Е.Г., Маянский А.Н. // Лаб. дело. - 1985. - 6. - С. 347-349.

13. Черешнева М. В., Шилов Ю.И., Баданина О.Н., Осотов С.В. // Иммунология. - 2000. - 1. - С. 26-29.

14. Щербаков В.И.//Лаб. дело. - 1989. - 1. - С. 31-32.

15. Alves Rosa M.F., Vulcano M., Minnucci F.S., Di Gianni P.D., Isturiz M.A. // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1997. - Vol. 83 (2). - P. 147-55.

16. Chello M. // Eur. J. Cardiothorac. Surg. - 1997. - Vol. 11 (l). - P. 162-68.

17. Clark J.L.// Del. Med. J. - 1973. -Vol. 45 (7). - P. 197-200.

18. De Toni S. // Ann. NYAcad. Sci. - 1997. - Vol. l5 (832). - P. 363-367.

19. Leino L., Lilius E.M. // J. Leukoc. Biol. - 1992. - Vol. 51 (2). - P. 157-63.

20. Matula G., Paterson P.Y. // N. Engl. J. Med. - 1971. - Vol. 285.- P. 311-14.

21. Middelhoven P.J., Van Buul J.D., Hordijk P.L., Roos D. // Clin. Exp. Immunol. - 2001.- Vol. 125 (l). - P. 169-75.

22. Park B.H., Fikrig S.M., Smithwick E.M. // Lancet. - 1968. - Vol. 2 (7567). - P. 532-4.

23. Richardson M.P., Ayliffe M.J., Helbert M., Davies E.G. // J. Immunol. Methods. - 1998. - Vol. 219. - P. 187-93.

24. Van S.R., Novak M.J. // Cell. Immunol. - 1999. - Vol. l95 (2). - P. 119-26.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследований. Сущность способа: венозную кровь человека центрифугируют на двойном градиенте плотности фиколл-верографина 1,118 и 1,076 г/мл, осуществляют гипотонический лизис примеси эритроцитов, доводят гранулоциты до концентрации 5•10⁶ кл/мл. Определяют уровень спонтанной и индуцированной активности, в качестве индукторов используют опсонизированный и неопсонизированный зимозан. При определении уровня спонтанной активности в лунку вносят 50 мкл 0,4%-ного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 50 мкл инкубационной среды и 100 мкл клеточной суспензии, а при определении уровня индуцированной активности в лунку вносят 50 мкл раствора НСТ, 50 мкл взвеси стимулятора и 100 мкл клеточной суспензии, планшет с пробами инкубируют при 37^oС, центрифугируют отделяют надосадок, добавляют этанол и снова центрифугируют, повторно отделяют надосадок, добавляют 0,85%-ный раствор NaCl и снова центрифугируют, после чего в каждую пробу добавляют димексид и инкубируют при 58-63^oC, добавляют раствор КОН, результаты реакции регистрируют на фотометре по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм. Способ обладает высокой чувствительностью. 1 табл.

Способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека, заключающийся в исследовании кислородзависимого метаболизма путем предварительного выделения пула нейтрофильных гранулоцитов, постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия в 96 луночных плоскодонных планшетах для иммунологических исследований и последующей фиксации результатов реакции с помощью многоканального фотометра, отличающийся тем, что в процессе выделения нейтрофилов венозную кровь человека центрифугируют на двойном градиенте плотности фиколл-верографина 1,118 г/мл и 1,076 г/мл, осуществляют гипотонический лизис примеси эритроцитов, доводят гранулоциты до концентрации 5·10⁶ кл/мл и оценивают их функциональное состояние по уровням спонтанной и индуцированной активности, причем при определении уровня спонтанной активности в лунку вносят 50 мкл 0,4%-ного раствора нитросинего тетразолия, 50 мкл инкубационной среды и 100 мкл клеточной суспензии, а при определении уровня индуцированной активности в лунку вносят 50 мкл раствора нитросинего тетразолия, 50 мкл взвеси стимулятора из расчета 15±3 частиц на клетку и 100 мкл клеточной суспензии, каждый вариант реакции проводят в 2 параллельных пробах, контроль реагентов осуществляют заменой клеточной суспензии эквивалентным объемом инкубационной среды, после внесения всех реагентов планшет с пробами инкубируют 20 мин при 37°С, затем центрифугируют 10 мин при 450-550 g, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл этанола и центрифугируют раствор 5 мин при 450-550 g, повторно отделяют надосадок, добавляют 200 мкл 0,85%-ного раствора NaCl и центрифугируют в том же режиме, после чего в каждую пробу добавляют 130 мкл димексида и инкубируют при 58-63°С 20 мин, затем добавляют 70 мкл раствора КОН и осуществляют пипетирование до равномерного окрашивания раствора, результаты реакции регистрируют на фотометре по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм, а оценку результатов проводят по спонтанному и индуцированному уровням активности нейтрофилов, выраженным в единицах оптической плотности, причем в качестве индукторов используют опсонизированный зимозан, для каждого из которых определяют коэффициент активации как отношение индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню активности, а по отношению индуцированного опсонизированным зимозаном уровня активности к индуцированному неопсонизированным зимозаном уровню определяют коэффициент опсонизации.